| 研究課題/領域番号 |
21659192
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 独立行政法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
小嶋 聡一 独立行政法人理化学研究所, 分子リガンド生物研究チーム, チームリーダー (10202061)
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| 研究期間 (年度) |
2009
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| 研究課題ステータス |
完了 (2009年度)
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| 配分額 *注記 |
3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
2009年度: 3,100千円 (直接経費: 3,100千円)
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| キーワード | TGf-β / 活性化反応 / プロテアーゼ / 血漿カリクレイン / 肝線維化 / ケミカルアレイ / ケミカルバイオロジー / 非アルコール性脂肪性肝炎 |
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| 研究概要 |
同手法のバリデーションをするため、最初に、モデルケースとして、ケミカルアレイを用いて血漿カリクレイン依存TGF-β活性化反応の阻害剤をみつけることができるかどうか、以下の3点について検討した。1)まず、肝組織抽出液の調製法について検討を行い、0.5%TritonX-100含有TrisバッファーpH7.4を用いてダウンス型ホモジナイザーで肝臓をすりつぶし超遠心した上清を用いるのが一番良く、潜在型TGF-βのみ検出でき、インキュベーションするとはじめて活性型TGF-βが検出される事を見出した。2)次に、TGF-βの検出法について検討を行い、遺伝子プロモーター上のTGF-βの刺激応答配列であるCAGAボックスを9つ有するリポーター遺伝子9xCAGA-Lucを高発現するミンク肺上皮細胞を作製した。同細胞を用いると、従来のELISAの検出限界(約10pg/ml)とほぼ同程度の検出感度で、培地に添加した検体中のTGF-β量を簡便に測定できることがわかった。そこで、1)で調製した肝抽出液を2)の細胞とインキュベーションし、そこにケミカルアレイでヒットしたインヒビターを入れて評価するハイスループット測定系を樹立した。3)ケミカルアレイを用いて血漿カリクレイン依存TGF-β活性化反応の阻害剤をスクリーニングしたところ、プロテアーゼ阻害剤に加えて、LAP切断配列に結合する事で活性化反応を阻害する新規化合物2種類がヒットした。以上の結果により、同手法のバリデーションができたと考えられ、現在、同手法を用いて、胆管結紮ラット肝線維化モデル肝臓、並びに非アルコール性脂肪性肝炎モデル肝臓中に存在する血漿カリクレイン以外の肝組織由来新規TGF-β活性化プロテアーゼの同定を行っている。
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