研究課題/領域番号 |
21659408
|
研究種目 |
挑戦的萌芽研究
|
配分区分 | 補助金 |
研究分野 |
形成外科学
|
研究機関 | 浜松医科大学 |
研究代表者 |
宮崎 数史 浜松医科大学, 医学部, リサーチアシスタント (10537418)
|
研究分担者 |
大野 浩司 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (90263277)
|
研究期間 (年度) |
2009 – 2010
|
研究課題ステータス |
完了 (2010年度)
|
配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2010年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
2009年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
|
キーワード | 外科 / 神経科学 / 移植・再生医療 |
研究概要 |
CLP36結合蛋白同定 野生型PC12細胞の1% Triton lysis bufferでホモジナイズし、可溶化蛋白の中からCLP36複合体を抗CLP36抗体(BD biosciences)-Dynabeads Protein G (Invitrogen)を用いて免疫沈降させた。この抗体が免疫沈降に使用できることは、すでに確認済みである(Tamura et al., BBRC 364:589-94, 2007)。沈降した蛋白群を0.5M NH_4OH, 0.5mM EDTAで溶出、SDS-PAGEによって分離・展開し、銀染色によってバンドとして可視化した。同時にコントロールとして、1)野生型PC12細胞に対しnormal IgGを使った免疫沈降、2)CLP36ノックダウンPC12細胞に対し抗CLP36抗体を使った免疫沈降、を施行し、これらの沈降産物との比較を行うことでCLP36複合体として現れている特異的なバンドを選び出した。 CLP36結合蛋白と見做されたバンドを、銀染色したゲルから1mmのブロックとして切り出し、還元化、アルキル化した後、トリプシン(Promega)によるゲル内消化を加えた。得られたペプチドをゲルから抽出し、LC-MS/MSによるペプチド酸配列の同定を行った。その結果をもとに検索エンジンを使い、蛋白の本体を明らかにした。本成果を主に、Neuroscience Letters誌(2010)において発表した。
|