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目的:細胞系譜特異的・時期特異的に発現誘導可能なRNA干渉法を単一細胞レベルで行い、モザイク表現型解析を可能とするベクター系の構築を目的とした。
方法および成果:初めに発現誘導可能なRNA干渉用ベクターとして、(1)shRNA発現プロモーター中に改変型loxPを導入し、Cre作用後、shRNAが発現するベクター(2)Cre作用後に、miRNAが発現するベクター(3)FLIP型miRNA発現ベクター:Cre発現前は、miRNAは、プロモーターに対して逆向きに挿入されているため発現しないが、Cre作用後2種類のloxPが特異的に反応し、プロモーター下流で、miRNAとmCherry(赤色蛍光蛋白質)が発現するベクターを構築した。次に培養細胞(HEK293T)において発現抑制効果を免疫染色法にて検討した。Creと(1)のベクターの共発現では、改変型loxPが機能せず、目的遺伝子の発現抑制が見られなかった。(2)のベクターでは、発現抑制が確認されたが、miRNA発現リークのためCre作用前に一部発現抑制が見られてしまっていた。(3) FLIP型miRNA発現ベクターでは、遺伝子発現抑制とmCherry発現を確認でき、Cre作用前のリークもなく誘導可能なベクターであった。続いて、まずCreの寄与がないmiRNA発現ベクターを子宮内電気穿孔法で導入しin vivoで単一細胞レベルの表現型が確認された。次に細胞系譜特異的・時期特異的プロモーター下でCreを発現するベクターを、Cre下流でGFPを発現するベクターと共に導入しCreの作用効果について検討した。その結果、Cre発現用のプロモーター特異性は確認された。ただし、その下流の遺伝子発現の細胞系譜特異性・時期特異性を実用的に制御するためには、さらに改変型Creを用い、効率を向上することが望ましいと考えられた。
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