研究課題/領域番号 |
21H01734
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研究種目 |
基盤研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分27040:バイオ機能応用およびバイオプロセス工学関連
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研究機関 | 早稲田大学 |
研究代表者 |
木野 邦器 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60318764)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
17,940千円 (直接経費: 13,800千円、間接経費: 4,140千円)
2023年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2022年度: 3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2021年度: 11,180千円 (直接経費: 8,600千円、間接経費: 2,580千円)
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キーワード | 環状ペプチド / ジケトピペラジン / ジケトモルフォリン / 生物活性 / 有機分子触媒 / 非リボソーム型ペプチド合成酵素 / アデニル化ドメイン / ジペプチド / ヒドロキシアミド / キラリティ / アミド化合物 |
研究開始時の研究の概要 |
本研究の概要は、生命が有する緻密なキラリティ制御や多様な生物機能を巧みに利用して、食品、医薬品、化成品など生活を豊かにする機能性化合物の効率的な合成法の開発を目指すことにある。具体的には多様な機能を有するタンパク質と同じようにアミノ酸が連結したペプチドとその結合様式に着目し、それを巧みに利用したキラリティ制御も可能な革新的な機能性アミド化合物の効率的合成法を開発する。生理活性や物理化学的特性の面で多様な機能性を発現する新規アミド化合物の創製とその拡張が期待されるため、医薬品原料や機能性化成品などの開発を行う研究である。
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研究実績の概要 |
我々は、アデニル化酵素を用いる化学酵素的アミド結合形成反応によるキラリティ制御可能な汎用性の高いアミド化合物合成法を基盤として、非標準型アミノ酸を含むジペプチドや環状ジペプチドであるジケトピペラジンのような特殊構造を有するペプチドの創製と効率的な合成法の開発を検討した。昨年度までに、非リボソーム型ペプチド合成酵素(NRPS)のアデニル化ドメイン(Aドメイン)をその制御下から解放して単独発現させることで、生理基質であるL-アミノ酸のみならずD-アミノ酸やその他の数種類のアミノ酸もアデニル化する興味深い現象を見出している。今年度は、本知見を踏まえてα-ケト酸を含有するペプチド合成を担うNRPSを構成するケトレダクターゼドメイン(KRドメイン)の上流に位置するAドメインが生理基質であるα-ケト酸に加えα-ヒドロキシ酸も基質になることを予想し、対象となるAドメインを拡張してそれを実証した。ケト酸アミドとα-ヒドロキシ酸アミドの合成に繋がった。ここで、求核剤としてアミノ酸メチルエステルを作用させると、結果的に分子内自発的環化によってジケトモルフォリンの合成が可能であると考えて検討した。 一方、本技術をさらに展開させて、ポリアミド化合物合成の可能性を検証した。化学酵素的アミド結合形成反応の特性を踏まえ、アデニル化されるカルボキシ基と求核攻撃を行うアミノ基を有する化合物を唯一の基質とすれば、ホモポリアミドの合成が可能と予想した。さらに、クリック反応による重合化の可能性を示した。 その他、アミノ酸α-リガーゼを用いるジペプチド合成において、カテコールアミン代謝活性を高めるβ-Ala-DOPAの効率的合成法の開発も行い、低コストプロセスとなる菌体反応系では対基質変換収率98%を達成した。さらに低コスト化を狙ってβ-Ala-Tyrからの変換プロセスも検討した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
ペプチド系抗生物質の生合成を担うNRPS由来のアデニル化ドメイン(Aドメイン)をその構成モジュールから切り出して単独発現させると、NRPS制御下で観察される特性とは異なる機能が発現することを明らかにしている。α-ケト酸を含むペプチド系抗生物質の生合成に関与するNRPS由来のα-ケト酸アデニル化ドメインにおいても、ケトレダクターゼドメインの上流に存在するα-ケト酸をアデニル化する数種類のAドメインすべてが対応するα-ヒドロキシ酸も認識することを明らかにした。本成果は、厳密な制御下にある機能ドメインには潜在的な特性が眠っていることを見出したもので、新たな機能ドメインの取得が可能であることを示した。また、α-ヒドロキシ酸を含むジペプチドになることで安定性が向上することを実証した。具体的には、L-Phe-L-ProとL-Phe をL-フェニル乳酸(L-PLA)に置き換えたL-PLA-L-Proの加水分解の程度を比較したところ、L-PLA-L-Proの方が明らかに分解耐性は高かった。また、多様な構造を有するジケトモリフォリンの創出にも大きく貢献するものである。 また、チロシンジンのAドメインを利用して単一アミノ酸のみを基質とすれば、ホモポリアミノ酸合成が可能と考えて検討したところ、2~9merのポリマーを確認することができた。さらに、当該反応が酵素・基質・求核剤の自由な組み合わせにより多様なアミド化合物の合成が可能になってきたので、クリック反応との連携を検討したところ、対応するオリゴマーの合成を確認することができた。新たな機能性高分子素材の開発の道を切り拓く有力な手段になり得ると期待する。 一方、β-Ala-Tyrからβ-Ala-DOPAへの変換プロセスでは、モノフェラーゼ活性の強いチロシナーゼを探索できたことで、90%以上のモル変換率を達成した。
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今後の研究の推進方策 |
新たな基質特異性を求めてNRPSのみならずドメイン構成が類似しているポリケチド合成酵素由来のAドメインも対象として評価を行う。また、エピメル化ドメインなど他の特徴的なドメインに関しても、モジュールからの切り出しと単独発現、そして機能評価を行い、それらドメインのモノづくり技術への利用の可能性を検討する。また、α-ヒドロキシ酸を含む多様なアミド化合物合成の可能性を背景として、ジケトピペラジンと同じように、それらが環化したジケトモルフォリンの効率的な合成法を検討する。また、環化方法に関しても、従来のエステル化による分子内自発的環化以外の方法を検討する。 一方、多様なジペプチドや環状ペプチドの合成が可能になってきたので、それら特殊構造ペプチドの生物活性を調査する。多様な生物活性が報告されているジケトピペラジンと対応するジケトモルフォリンでの比較解析も行い、新たな医薬品や農薬、化成品などへの利用展開を検討する。具体的には、我々の研究と連携している3研究機関の研究者の協力を得て実施する。有用な機能性が見いだせた場合、知財の権利化と社会実装を見据えて企業との新たな連携の可能性を模索する。 さらに、合成可能となった特殊構造ジペプチドなどを基質して脱水素反応や酸化反応などの二次修飾を行う酵素を探索し、新たな構造変換の可能性を検討する。 多様な特殊構造を有するアミド化合物合成では、我々が既に発見しているオリゴペプチド合成活性を有するアミノ酸α-リガーゼの利用も積極的に検討する。
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