| 研究課題/領域番号 |
21H02057
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37010:生体関連化学
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| 研究機関 | 関西大学 |
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研究代表者 |
遠藤 政幸 関西大学, 研究推進部, 特別任命教授 (70335389)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2023年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2022年度: 4,680千円 (直接経費: 3,600千円、間接経費: 1,080千円)
2021年度: 8,190千円 (直接経費: 6,300千円、間接経費: 1,890千円)
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| キーワード | 遺伝子発現 / エピジェネティクス / DNAオリガミ / 高速原子間力顕微鏡 / １分子観察 / ヌクレオソーム / 1分子観察 / 原子間力顕微鏡 / エピジェネティックズ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、「ヌクレオソーム多量体の高次構造とクロマチン構造への形態変化」及び「ヌクレオソーム多量体の遺伝子発現制御への連動」について1分子可視化とその反応機構の解明を行う。遺伝子発現の制御に連動する配列化されたヌクレオソーム多量体の高次構造について、これらをDNAオリガミ構造体に集積し、高速原子間力顕微鏡（AFM）により動的な状態で1分子可視化する。これにより、遺伝子発現に必要な転写因子との複合化、複数のヌクレオソーム多量体からクロマチン構造形成と相分離まで至る機構を動的に可視化・解析する。さらに、転写活性化まで含めたエピジェネティックな遺伝子発現を可視化しその反応機構を解明する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、遺伝子発現の制御に連動する配列化されたヌクレオソーム多量体の高次構造について、これらをDNAオリガミ構造体に集積し、DNAオリガミの持つ空間を使って、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）により動的な状態で１分子の解像度で可視化する技術を開発する。今年度は、ヌクレオソーム多量体を観察するためのDNAオリガミ構造体を作製した。２次元長方形中心部に1,000塩基対あるいは1,500塩基対の２本鎖DNAを配した構造体を作製し高速AFM観察を行った。また、ヌクレオソーム多量体を結合するためヌクレオソーム結合サイト間の距離を25塩基対あるいは30塩基対の間隔に制御した２本鎖DNAを合成した。DNAオリガミに結合するリンカーを導入したPCR生成物によりヒストン多量体の再構成を行った。また、ヒストンH1を模して、２本鎖DNAの複数個所を結合安定化する人工の転写因子の開発を行った。前年度に引き続きDNA配列認識分子としてdCas9/sgRNA複合体をRNA鎖を介して２量化し、様々なコンフォメーションでターゲット２本鎖DNAの配列化に成功した。
エピジェノミック修飾がヌクレオソーム相互作用に与える影響観察するため、代表的なヒストンテール修飾であるH3 K9me3を導入したヌクレオソームを作製した。H3 K9C変異体を2-bromoethyltrimethylammoniumでアルキル化し誘導体を作製し質量分析で合成を確認した。再構成後、DNAオリガミ構造体に導入し、修飾ヌクレオソーム間の相互作用を高速AFMで観察した。修飾ヌクレオソームはDNAオリガミ構造体内で安定に存在でき、ヌクレオソーム間の相互作用とH3 K9me3に相互作用するHP1 (heterochromatin protein 1)により安定化されることが高速AFMにより観察された。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度が最終年度であるため、記入しない。
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