核共鳴散乱分光を駆使した鉄複核中心と気体分子の化学の解明

• 研究課題/領域番号: 21H02064
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分37010:生体関連化学
• 研究機関: 兵庫県立大学 (2023); 国立研究開発法人理化学研究所 (2021-2022)
• 研究代表者: 當舎 武彦 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (00548993)
• 研究分担者: 堀谷 正樹 佐賀大学, 農学部, 准教授 (80532134)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円); 2023年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2022年度: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2021年度: 9,230千円 (直接経費: 7,100千円、間接経費: 2,130千円)
• キーワード: 金属酵素 / 一酸化窒素 / ヘム / 反応中間体 / 核共鳴非弾性散乱 / 低温光解離 / ケージド化合物 / 振動分光 / 一酸化窒素還元酵素 / 電子スピン共鳴 / 二核鉄中心 / 核共鳴散乱分光 / クライオフォトリシス

研究開始時の研究の概要

生体内の温和な条件下で高活性を示す金属酵素の作動原理を理解するためには、触媒反応中に形成される反応中間体の構造を決定することが重要である。本課題では、光解離性のケージド基質の低温光解離と温度制御を組み合わせることで、短寿命反応中間体を捕捉し、その詳細な構造決定に挑む。ヘム鉄と非ヘム鉄からなる複核活性中心において、二分子の一酸化窒素（NO）を亜酸化窒素（N2O）に還元・無毒化するNO還元酵素（NOR）を研究対象とし、ケージドNOを利用して捕捉した反応中間体の電子・原子構造を核共鳴散乱分光法により決定することで、鉄複核中心と気体分子の化学について理解するとともに、本研究手法の有用性を実証する。

研究成果の概要

ヘム鉄および非ヘム鉄からなる複核活性中心において、一酸化窒素（NO）の還元反応を触媒する膜結合型NO還元酵素（NOR）の反応機構解明を目指した。還元型NORと光照射によりNOを発生するケージドNOを混合・凍結し、液体窒素温度で紫外光照射を行いケージドNOの低温光解離を促した。その後、温度制御を行うことでNOが試料中を拡散し、反応中間体が捕捉できることを見出した。そして、電子スピン共鳴分光によりNORの最初の反応中間体は、非ヘム鉄にNOが結合した状態であることを明らかにした。また、同手法を放射光を用いた振動分光である核共鳴非弾性散乱（NRVS）測定に適用し、反応中間体の化学種に関する情報を得た。

研究成果の学術的意義や社会的意義

NORによるNO還元には、鉄へのNOの結合、電子移動、プロトン輸送、化学結合の形成（N-N結合）および開裂（N-O結合）といった、化学反応の基礎が詰め込まれており、その反応機構を理解することは、化学反応の本質の理解に迫るものである。酵素そのものを使って、反応中間体を捕捉・解析した本成果は、近年、主流となっているNORの理論研究やモデル錯体を用いた研究に対して一石を投じるものであり、今後の反応機構の理解に大きく貢献する。また、NORは、病原菌の感染や地球環境とも関連が深いため、その反応機構の理解は、これらの研究分野を含む多くの他分野への影響が期待できる。

研究成果

• [国際共同研究] ゴッセンベルグ大学(スウェーデン)
• [国際共同研究] インペリアルカレッジロンドン(英国)
• [国際共同研究] Diamond Light Source/University of Liverpool/University of Essex(英国)
• [国際共同研究] University of Liverpool/University of Essex/Diamond Light Source(英国)
• [雑誌論文] Catalytic Oxidation of Methane by Wild-Type Cytochrome P450BM3 with Chemically Evolved Decoy Molecules (2023)
  • 著者名/発表者名: Ariyasu Shinya、Yonemura Kai、Kasai Chie、Aiba Yuichiro、Onoda Hiroki、Shisaka Yuma、Sugimoto Hiroshi、Tosha Takehiko、Kubo Minoru、Kamachi Takashi、Yoshizawa Kazunari、Shoji Osami
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 13 号: 13 ページ: 8613-8623
  • DOI: 10.1021/acscatal.3c01158
  • 査読あり
• [雑誌論文] Serial Femtosecond Crystallography Reveals that Photoactivation in a Fluorescent Protein Proceeds via the Hula Twist Mechanism (2023)
  • 著者名/発表者名: Fadini Alisia et al.
  • 雑誌名: Journal of the American Chemical Society 巻: 145 号: 29 ページ: 15796-15808
  • DOI: 10.1021/jacs.3c02313
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Time-resolved serial crystallography to track the dynamics of carbon monoxide in the active site of cytochrome c oxidase (2023)
  • 著者名/発表者名: Safari Cecilia et. al.
  • 雑誌名: Science Advances 巻: 9 号: 49 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1126/sciadv.adh4179
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Trapping of a Mononitrosyl Nonheme Intermediate of Nitric Oxide Reductase by Cryo-Photolysis of Caged Nitric Oxide (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeda Hanae、Shimba Kanji、Horitani Masaki、Kimura Tetsunari、Nomura Takashi、Kubo Minoru、Shiro Yoshitsugu、Tosha Takehiko
  • 雑誌名: The Journal of Physical Chemistry B 巻: 127 号: 4 ページ: 846-854
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c05852
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural basis for heme detoxification by an ATP-binding cassette?type efflux pump in gram-positive pathogenic bacteria (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakamura Hiro、Hisano Tamao、Rahman Md. Mahfuzur、Tosha Takehiko、Shirouzu Mikako、Shiro Yoshitsugu
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 号: 27
  • DOI: 10.1073/pnas.2123385119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single crystal spectroscopy and multiple structures from one crystal (MSOX) define catalysis in copper nitrite reductases (2022)
  • 著者名/発表者名: Rose Samuel L.、Baba Seiki、Okumura Hideo、Antonyuk Svetlana V.、Sasaki Daisuke、Hedison Tobias M.、Shanmugam Muralidharan、Heyes Derren J.、Scrutton Nigel S.、Kumasaka Takashi、Tosha Takehiko、Eady Robert R.、Yamamoto Masaki、Hasnain S. Samar
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 119 号: 30
  • DOI: 10.1073/pnas.2205664119
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Complementarity of neutron, XFEL and synchrotron crystallography for defining the structures of metalloenzymes at room temperature (2022)
  • 著者名/発表者名: Moreno-Chicano, Carey, Axford, Beale, Doak, Duyvesteyn, Ebrahim, Henning, Monteiro, Myles, Owada, Sherrell, Straw, Srajer, Sugimoto, Tono, Tosha T., Tews, Trebbin, Strange, Weiss, Worrall, Meilleur, Owen, Ghiladi, Hough
  • 雑誌名: IUCrJ 巻: 9 号: 5 ページ: 610-624
  • DOI: 10.1107/s2052252522006418
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Serial Femtosecond Crystallography Reveals the Role of Water in the One- or Two-Electron Redox Chemistry of Compound I in the Catalytic Cycle of the B-Type Dye-Decolorizing Peroxidase DtpB (2022)
  • 著者名/発表者名: Lucic Marina、Wilson Michael T.、Tosha Takehiko、Sugimoto Hiroshi、Shilova Anastasya、Axford Danny、Owen Robin L.、Hough Michael A.、Worrall Jonathan A. R.
  • 雑誌名: ACS Catalysis 巻: 12 号: 21 ページ: 13349-13359
  • DOI: 10.1021/acscatal.2c03754
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Identifying antibiotics based on structural differences in the conserved allostery from mitochondrial heme-copper oxidases. (2022)
  • 著者名/発表者名: Nishida Y, Yanagisawa S, Morita R, Shigematsu H, Shinzawa-Itoh K, Yuki H, Ogasawara S, et al
  • 雑誌名: Nat Commun. 巻: 13 号: 1 ページ: 7591-7591
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34771-y
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Mechanism of substrate inhibition in cytochrome-c dependent NO reductases from denitrifying bacteria (cNORs) (2022)
  • 著者名/発表者名: Matsumura Hirotoshi、Faponle Abayomi S.、Hagedoorn Peter-Leon、Tosha Takehiko、de Visser Sam P.、Moenne-Loccoz Pierre
  • 雑誌名: Journal of Inorganic Biochemistry 巻: 231 ページ: 111781-111781
  • DOI: 10.1016/j.jinorgbio.2022.111781
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Short-lived intermediate in N2O generation by P450 NO reductase captured by time-resolved IR spectroscopy and XFEL crystallography (2021)
  • 著者名/発表者名: Nomura, T., Kimura, T., Kanematsu, Y., Yamada, D., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Murakami, H., Hisano, T., Yamagiwa, R., Takeda, H., Gopalasingam, C., Kousaka, R., Yanagisawa, S., Shoji, O., Kumasaka, T., Yamamoto, M., Takano, Y., Sugimoto, H., Tosha, T., Kubo, M., Shiro, Y
  • 雑誌名: Proceedings of the National Academy of Sciences 巻: 118 号: 21
  • DOI: 10.1073/pnas.2101481118
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • 著者名/発表者名: Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
  • 雑誌名: Angewandte Chemie International Edition 巻: - 号: 26 ページ: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Heme controls the structural rearrangement of its sensor protein mediating the hemolytic bacterial survival (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishinaga Megumi、Sugimoto Hiroshi、Nishitani Yudai、Nagai Seina、Nagatoishi Satoru、Muraki Norifumi、Tosha Takehiko、Tsumoto Kouhei、Aono Shigetoshi、Shiro Yoshitsugu、Sawai Hitomi
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 4 号: 1 ページ: 467-467
  • DOI: 10.1038/s42003-021-01987-5
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Mechanism of nitric oxide reduction by P450 in fungal denitrification (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: 日本薬物動態学会第38回年会/第23回シトクロムP450国際会議国際合同大会
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Characterization of the short-lived reaction intermediate of NO reductase with caged substrate (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: Dynamic Crystallography-XFELs and Synchrotrons to study enzyme reactions
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Characterization of reaction intermediates of nitric oxide reductases involved in denitrification (2023)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: ThermusQ高度好熱菌研究を切り拓くネオテクノロジー
• [学会発表] ケージド基質の低温光解離を利用した金属酵素反応中間体の捕捉 (2023)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、武田英恵、榛葉幹治、堀谷正樹、城宜嗣
  • 学会等名: 第49回生体分子科学討論会
• [学会発表] 嫌気呼吸酵素を標的とした緑膿菌の抗菌薬開発に向けて (2023)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、川上凌平、Chai Gopalasingam、重松秀樹、西田優也、新谷泰範
  • 学会等名: 第2回生命金属科学シンポジウム
• [学会発表] NO reduction chemistry at heme/non-heme binuclear active center proved by methods using photo-sensitive caged NO (2022)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Mechanism of biological nitric oxide reduction proved by time-resolved structural analysis (2022)
  • 著者名/発表者名: Takehiko Tosha
  • 学会等名: REDOX WEEK IN SENDAI 2022, 4th International conference on persulfide and sulfur metabolism in biology and medicine
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Elucidation of Mechanisms for Catalytic Reaction of Nitric Oxide Reductases by Time-resolved Techniques (2022)
  • 著者名/発表者名: T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro, M. Kubo
  • 学会等名: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP)-12
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光解離性基質の低温光解離を利用した金属酵素短寿命反応中間体の同定 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第61回電子スピンサイエンス学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を用いた金属酵素反応機構の解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: メタルバイオサイエンス研究会2022
  • 招待講演
• [学会発表] 酸素バリア性フィルムを利用した嫌気下での構造解析の試み (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦、榛葉幹治、松浦滉明、平田邦生、山本雅貴、城宜嗣
  • 学会等名: 第60回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 金属酵素活性中心における一酸化窒素還元反応の分子機構 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 物性研短期研究会「理論タンパク質物性科学の最前線：理論と実験との密な協働」
  • 招待講演
• [学会発表] 各種分光計測を駆使した鉄活性中心における一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2022)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Time-resolved techniques provide mechanism for nitric oxide reduction by nitric oxide reductase (2021)
  • 著者名/発表者名: Tosha T., Takeda H., Shiro Y., Kubo M.
  • 学会等名: Pacifichem 2021
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 光解離性ケージド基質を利用した一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2021)
  • 著者名/発表者名: 當舎武彦
  • 学会等名: 第94回日本生化学大会
  • 招待講演
• [図書] 第4章、第2節 生体鉄の分子科学と細胞生物学、“生命金属ダイナミクス 生体内における金属の挙動と制御” (2021)
  • 著者名/発表者名: 城 宜嗣、澤井仁美、當舎武彦
  • 総ページ数: 13
  • 出版者: NTS出版
• [備考] 反応途中の酵素を観る新手法の開発
  • URL: https://www.riken.jp/press/2023/20230111_2/index.html