研究課題/領域番号 |
21H02080
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研究種目 |
基盤研究(B)
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配分区分 | 補助金 |
応募区分 | 一般 |
審査区分 |
小区分37030:ケミカルバイオロジー関連
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研究機関 | 大阪大学 |
研究代表者 |
樺山 一哉 大阪大学, 大学院理学研究科, 准教授 (00399974)
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研究分担者 |
狩野 裕考 東北医科薬科大学, 薬学部, 助教 (40774279)
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研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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配分額 *注記 |
16,900千円 (直接経費: 13,000千円、間接経費: 3,900千円)
2023年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2022年度: 5,590千円 (直接経費: 4,300千円、間接経費: 1,290千円)
2021年度: 5,720千円 (直接経費: 4,400千円、間接経費: 1,320千円)
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キーワード | 自然免疫 / サイトカイン解析 / イメージング / フローサイトメトリー / ライブセルイメージング / TLR4 / リポポリサッカライド / スフィンゴミエリン / 生細胞イメージング / リピドA / 細胞イメージング / 糖脂質 / LPS |
研究開始時の研究の概要 |
本研究では、TLR4リガンド構造に応じたTLR4/MD2の細胞内動態の解析と、サイトカイン生成プロモーター活性の高感度検出を組み合わせることで、サイトカイン産生経路の仕分けを厳密に評価するシステムを構築する。この研究により、臨床においても有用な新規アジュバントの探索に、いち早く貢献できると考える。
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研究実績の概要 |
本年度はまず、マウス骨髄由来細胞を単離し、BMDCおよびBMDMに分化させ、それぞれが解析利用に足るものであることを、フローサイトメトリーおよび形態学的に確認した。またこの免疫系細胞にLPSで刺激を行ったところ、マウスマクロファージ様細胞株RAW264.7を比較して、数倍のサイトカイン分泌能を示したことから、リガンド構造のわずかな違いによるサイトカイン放出能の評価を行うのに適している細胞であることを確認した。 但しRAW264.7も簡便に利用できることから引き続きこの細胞も用いて検討を行う。続いて、フローサイトメトリーを用いてTLR4/MD2の細胞内移行の評価系を構築した。抗体には、LPSの結合の有無にかかわらず全てのTLR4を認識するSa15-21、および活性化(リガンド結合し二量体化する)前の単量体TLR4を認識するMTS510を用いた。リガンドには、昨年から引き続きEcLPSおよびRsLPSを用いた他、本研究においてスフィンゴミエリンがその脂肪酸鎖の長さの違いにより活性化能を調節できることが判明したので、これを用いて検討した。その結果、EcLPSおよびRsLPSについては予想通りのTLR4二量体化と内在化の解析結果が得られ、スフィンゴミエリンも同様に、濃度依存的、LPSとの共存によるアゴニスト・アンタゴニスト活性を評価することができた。スフィンゴミエリンについては、HEK-Blue TLR4細胞を用いたSEAPアッセイによるNF-kB活性評価、ならびにIL-6、IL1-βなどの各種サイトカイン放出能のELISAによる評価とほぼ傾向が一致した。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ほぼ研究計画の行程で進んでいる。さらに本研究で新たにスフィンゴミエリンが内因性の活性調節リガンドとなりえることも判明したことから、この事象のデータも取得し、結果を充実させていく。
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今後の研究の推進方策 |
イメージング、フローサイトメトリーにより、内在化能が比較的異なる分子を選択し、高感度レポーターアッセイも含めて、体系的なデータを取りまとめ、発表および論文化を進める。また、スフィンゴミエリンをリガンドとする研究も加えて、さらに展開していく。スフィンゴミエリンに関しては、TLR4/MD2を介した炎症性サイトカイン分泌経路とは別に、パイロトーシス経路を活性化している結果が得られているため、こちらの経路を評価できる系も構築していく。イメージングについては、所属研究室において完全合成された蛍光標識LipidAが供給される予定であるため、これも併せて評価していく。
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