| 研究課題/領域番号 |
21H02155
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分38060:応用分子細胞生物学関連
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
高橋 和利 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (80432326)
|
|---|
| 研究分担者 |
岩崎 未央 京都大学, iPS細胞研究所, 講師 (10722811)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
|
| 配分額 *注記 |
17,290千円 (直接経費: 13,300千円、間接経費: 3,990千円)
2023年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2022年度: 7,020千円 (直接経費: 5,400千円、間接経費: 1,620千円)
2021年度: 5,070千円 (直接経費: 3,900千円、間接経費: 1,170千円)
|
|---|
| キーワード | 環状RNA / 非標準的翻訳 / 多能性幹細胞 / 翻訳 / リボソームプロファイリング |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
本研究は、mRNAのスプライシング時に副産物として生成される環状RNA (circular RNA: circRNA) がタンパク質に翻訳され、生理学的な役割を持つことを証明する。circRNAの接合部位配列はゲノム上に存在しないため、従来のゲノミクスをベースとした手法では解析が困難であり、その機能についてはほとんど知られていない。
そこで本研究では、従来見過ごされてきたcircRNA由来翻訳産物を同定することで現行タンパク質カタログを大幅に拡張する。これをもとに機能的スクリーニングを行い、ヒト分化多能性幹細胞の性質に重要な役割を果たしているcircRNAを同定する。
|
| 研究実績の概要 |
本研究課題は、これまで見過ごされてきたcircRNAの翻訳機構と翻訳産物の生理的意義を解明することを目的としている。circRNAはその配列が遺伝子座を共有するmRNAと重複することからマッピングの際に判別が困難である。また、circRNAはゲノム上に存在しない接合部位配列を有することから、mRNAや直鎖今コーディングRNAなどの線状RNAと同様の方法ではマッピングができない。2022年度は、ヒト分化多能性幹細胞株 (H9 ES細胞およびWTB6 iPS細胞) から抽出・精製したトータルRNAを、線状RNA特異的消化酵素であるRNase Rで処理した。さらにcircRNAの純度を高めるために、RNase Rで消化しきれなかった線状RNAの末端にpoly Aを人工的に付加し、dTビーズとハイブリダイゼーションしたRNAを取り除いた。こうして得られたRNAを用いてシークエンス用ライブラリーを作製し、次世代シークエンサーによるデータ取得を行った。得られたデータについて、独自に構築した解析パイプラインを用いて、circRNAのマッピングを行い、二株の独立した分化多能性幹細胞株で共通して発現するcircRNAを同定した。
さらに、翻訳状態を塩基レベルで定量化する目的で、リボソーマルプロファイリング実施した。現在、circRNAのマッピング情報と被翻訳RNAの情報を合わせて解析中である。
翻訳されているcircRNAが同定できたあとは、そこから実際にタンパク質が生成されていることを確認する必要がある。我々はこれまでに、共同研究者とともに質量分析の感度を向上させる条件検討を実施し、成果を得てきた。また、circRNAから生成されるタンお悪質は分子量が小さいことが考えられるため、小さなタンパク質を効率良く検出する方法を重点的に検討している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までに準備した実験系がうまく機能し、良好な成果が得られている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
質量分析を用いて分化多能性幹細胞で発現する低分子量タンパク質を網羅的に同定し、circRNAの翻訳領域と照らし合わせる。さらに、同定したcircRNAに対するsgRNAライブラリーを構築し、機能スクリーニングを実施することでヒト分化多能性幹細胞の自己複製に必須なcircRNAの同定を試みる。
|
