| 研究課題/領域番号 |
21H02389
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(B)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分42040:実験動物学関連
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
浅野 雅秀 京都大学, 医学研究科, 教授 (50251450)
|
|---|
| 研究分担者 |
成瀬 智恵 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30372486)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
|
| 配分額 *注記 |
17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円)
2023年度: 5,200千円 (直接経費: 4,000千円、間接経費: 1,200千円)
2022年度: 5,980千円 (直接経費: 4,600千円、間接経費: 1,380千円)
2021年度: 6,240千円 (直接経費: 4,800千円、間接経費: 1,440千円)
|
|---|
| キーワード | ガラクトース糖鎖 / 造血幹細胞 / ホーミング / 血液細胞分化 / 骨髄ニッチ |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
同種造血幹細胞移植は難治性造血器腫瘍や再生不良性貧血などに対する根治的治療法として広く実施されるが，HSCの骨髄へのホーミング・生着効率や血球細胞への分化効率の向上は臨床現場の大きな課題となっている。本研究はHSCの細胞表面の糖鎖が，HSCの骨髄へのホーミング・生着や血球細胞への分化に重要な働きをしていることの発見を起点に，上記の課題の解決を目指すものである。全身および造血前駆細胞特異的β4GalT-1欠損マウスのHSCや造血前駆細胞の表面分子の解析，及び候補分子の糖鎖付加部位の改変により，どのような糖タンパク質のどの糖鎖構造がホーミングや分化に重要であるかを明らかにする。
|
| 研究実績の概要 |
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
これまでのHSCの骨髄へのホーミングに必須のCXCR4の解析において，そのリガンドCXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在するN型糖鎖やO型糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入した変異型CXCR4を作製した。これを培養細胞に導入して，Wound healing assayとTranswell migration assayで遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。そこでCRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。
２）HSC特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
CXCL12との結合に重要なCXCR4のN末端の38アミノ酸に存在する糖鎖の付加可能部位にそれぞれ点変異を導入してCXCL12への遊走活性を測定したところ，２ヶ所のO型糖鎖の付加可能部位が重要であることがわかった。さらに，CXCR4の遊走活性シグナル伝達に関与するFAKなどのリン酸化が，この２ヶ所の変異で低下することがわかった。また，レクチンブロットやウエスタンブロット解析により，この２ヶ所にはO型糖鎖が結合していることが示唆された。現在，CRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，おおむね順調に進展していると判断した。
２）HSC特異的およびMEP特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中であり，おおむね順調に進展していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
１）HSCのホーミングや分化の制御に関わる糖タンパク質とその糖鎖構造の解明
CRISPR/Cas9法を用いてCXCR4遺伝子にこの２ヶ所の変異を導入したマウスを作製中であり，目的のマウスが作製できたら，このマウスから調整したHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。上記の実験がうまく進まない場合も想定して，すでに作製したCXCR4欠損マウスのHSCにレンチウイルスベクターを用いて変異型CXCR4を導入して，骨髄へのホーミング・生着能を解析する。
２）HSC特異的およびMEP特異的β4GalT-1欠損マウスの作製と解析
HSCや造血前駆細胞で特異的にCreを発現するVav-iCreマウスとβ4GalT-1 floxマウスの交配により，HSC特異的β4GalT-1欠損マウスを作製中である。このマウスのHSCを野生型マウスに移植して，骨髄へのホーミング・生着能を解析することにより，ホーミング異常がHSCの糖鎖欠損によることを証明する。また，このマウスの骨髄細胞の分化段階をFACSで解析して，HSCの分化異常がその糖鎖異常に起因することを明らかにする。
|
