| 研究課題/領域番号 |
21H02408
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (80380525)
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| 研究分担者 |
久米田 博之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 学術専門職 (00399966)
杉田 征彦 京都大学, 医生物学研究所, 准教授 (00734469)
于 健 大阪大学, 蛋白質研究所, 特任講師(常勤) (20587860)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,550千円 (直接経費: 13,500千円、間接経費: 4,050千円)
2023年度: 2,600千円 (直接経費: 2,000千円、間接経費: 600千円)
2022年度: 6,760千円 (直接経費: 5,200千円、間接経費: 1,560千円)
2021年度: 8,190千円 (直接経費: 6,300千円、間接経費: 1,890千円)
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| キーワード | 複合体解析 / 相互作用解析 / NMR / クライオ電顕 / 結晶解析 / シグナル伝達阻害 / ウイルス蛋白質 / クライオ電子顕微鏡 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ウイルスがどの生物を宿主として選択するかを考える上で，宿主免疫系を不活化できるかどうかは非常に大きな要因である。多くのウイルスは宿主の免疫分子と結合するための蛋白質を準備し，固有の方法で免疫系を制圧する。本申請では，ヒトに重篤な障害・死をもたらすRNAウイルスが，ヒトJAK-STAT経路を不活化する戦略を明らかにする。私達はウイルスの蛋白質および宿主蛋白質を調製し，生化学研究を進めてきた。その結果，蛋白質間相互作用を担う領域が明らかになったため，複合体構造情報を得る。さらに，立体構造および生化学の結果を細胞生物学で評価し，ウイルスの科や属ごとに共通，或いは特異的な特徴を捉える。
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| 研究実績の概要 |
ウイルスがどの生物を宿主として選択するかを考える上で，宿主免疫系を不活化できるかどうかは非常に大きな要因である。多くのウイルスは宿主の免疫分子と結合するための蛋白質を準備し，固有の方法で免疫系を制圧する。本研究では，ヒトに重篤な障害・死をもたらすRNAウイルスが，ヒトJAK-STAT経路を不活化する戦略を明らかにしてきた。
麻疹ウイルスV蛋白質のN末端ドメインはSTAT1と，C末端ドメインはSTAT2とそれぞれ特異的に結合するが，さらに我々は，C末端ドメインを削ったコンストラクトの作成に成功し，ゲル濾過クロマトグラフィ等で相互作用解析をおこない，結合最小領域であることを突き止めた。X線結晶構造解析を目指し，現在共結晶化試行中である。本結果は生物物理学会等で報告した。また，このドメインは単独で結晶化しないと予測されることから，NMR構造解析に着手しており，1H-15N HMQCにより測定条件の検討を進めた。
狂犬病ウイルスP蛋白質とSTATの電子顕微鏡単粒子解析では，相互作用評価をさらに綿密におこなった。また，STATのループ領域にNZ1抗体のエピトープ配列を挿入し，NZ1clasp抗体を使ってSTATの性質を変える試みをおこなった。NZ1抗体が結合した状態で，STATとPとの同程度のKD値が得られたため，こちらの電顕構造解析のためのグリッド作成もおこなう予定である。複合体形成条件や氷包埋条件の検討を進め，200 kV電顕により測定をおこなった後３次元モデル構築をおこない，適切な条件を評価中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
麻疹ウイルスV蛋白質とSTATとの複合体構造解析においては，最小領域が絞れたため，多様な結晶化条件を探索する段階にきた。麻疹ウイルスV蛋白質C末端ドメインのNMR構造解析においても，効率の良い条件探索段階に到達できており，この２つは順調である。狂犬病ウイルスP蛋白質とSTATとの電顕複合体構造解析においては，STATの密度は見られるものの，Pの密度は今のところ確認できていないため，予定より少し遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
麻疹ウイルスV蛋白質とSTATとの複合体結晶化試行において，できるだけ多条件を検討し，速やかに放射光に結晶を送付して，自動測定により結晶を探索するという実験を効率的におこなう。麻疹ウイルスV蛋白質C末端ドメインのNMR構造解析は，機械的に条件が決定できれば，HNCOCAなど各種三次元測定をおこなって，NOE情報から構造解析をおこなう。狂犬病ウイルスP蛋白質とSTATとの電顕複合体構造解析は，グリッド作成条件を多方面（STATにに対する変異や，エポキシ化したグリッド）から検討する。
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