| 研究課題/領域番号 |
21H02413
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
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| 研究機関 | 大阪医科薬科大学 |
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研究代表者 |
藤橋 雅宏 大阪医科薬科大学, 医学部, 准教授 (10397581)
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| 研究分担者 |
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
17,680千円 (直接経費: 13,600千円、間接経費: 4,080千円)
2023年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2022年度: 4,420千円 (直接経費: 3,400千円、間接経費: 1,020千円)
2021年度: 8,840千円 (直接経費: 6,800千円、間接経費: 2,040千円)
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| キーワード | 結晶構造 / ピロリン酸 / リン酸化酵素 / 結晶構造解析 / ピロリン酸依存性リン酸化酵素 / 無細胞タンパク質合成 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
「リン酸化反応」は生体内で広く見られる化学反応です。様々な化合物が「リン酸化」されることが知られており、それぞれの化合物に対応した「リン酸化酵素」が存在します。一方でリン酸化反応に必要な「リン酸」は、ほとんど全ての場合、ATPという分子から供給されます。これに対して私達は「ピロリン酸」という分子をリン酸の供給源とするリン酸化酵素を発見しました。ピロリン酸はATPと比べて3桁安いこと、リン酸化反応はうまみ調味料の製造や化粧品の美白成分などにも関連することなどから、様々な化合物の安価で安全なリン酸化をめざして、ピロリン酸依存性のリン酸化酵素の天然からの発掘や、人工的な構築を行います。
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| 研究実績の概要 |
本研究では様々な生物から多数のPPi-kinaseを同定し、ATP以外の化合物のうちPPiが生物界の至る所でリン酸基供与体として利用されていることを示すことを目指している。また、同定したPPi-kinaseの立体構造をもとに、天然のPPi-kinaseがリン酸化できない化合物をリン酸化する酵素設計戦略の構築も目指している。
2022年度およびその繰越年度では、これまでに見いだしたPPi-kinaseの一つについて、酵素学的パラメーターの取得を目指した系の構築を行った。活性の測定はPPi-kinaseによる触媒反応の副産物である無機リン酸を、マラカイトグリーンの呈色を利用して検出する。データを効率的に取得するために、プレートリーダー、自動ピペットや八連ピペットの利用など、様々なツールの利用を検討した。構築した手法によりPPi-kinaseの予備的な活性測定を行ったところ、十分に測定が可能である事を確かめた。
また同定したPPi-kinaseについて、基質複合型の結晶構造解析に取り組んだ。解析に必要な結晶の取得は難航したが、結晶化の条件を様々に改善することで解析可能な結晶を得た。構造解析の結果、活性残基、リン酸基受容基質を認識する残基、ならびにPPi認識残基を明らかにすることができた。PPi認識残基についてはATP-kinaseには見られない残基であり、部位特異的変異を導入して予備的な活性測定を行ったところ、活性が下がることが確かめられた。今後このPPi認識残基を鍵情報として、ATP-kinaseをPPi-kinaseに改変することを計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
PPi-kinaseと基質複合体の結晶取得に難航したため、遅れが生じている。現在は必要な構造を決定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究により、PPi-kinaseの活性測定系の構築、PPi-kinase基質複合体の結晶構造解析が完了している。これらのデータを基に、遺伝子データベースに眠る新規PPi-kinaseを同定する。また、ATP-kinaseをPPi依存性に変換する手法を構築する。
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