| 研究課題/領域番号 |
21H04729
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
中区分39:生産環境農学およびその関連分野
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
野々村 賢一 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 准教授 (10291890)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-05 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
41,600千円 (直接経費: 32,000千円、間接経費: 9,600千円)
2024年度: 7,930千円 (直接経費: 6,100千円、間接経費: 1,830千円)
2023年度: 8,450千円 (直接経費: 6,500千円、間接経費: 1,950千円)
2022年度: 8,060千円 (直接経費: 6,200千円、間接経費: 1,860千円)
2021年度: 8,840千円 (直接経費: 6,800千円、間接経費: 2,040千円)
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| キーワード | 減数分裂 / 植物 / 生殖 / エピゲノム / 細胞壁リプログラミング / イネ / 小分子RNA / エピジェネティクス / 細胞壁 / カロース / 葯 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
生殖細胞は、ゲノム撹乱要因であるトランスポゾンの不活化によりゲノム恒常性を維持する一方、新たな遺伝子組み合わせを創出して次世代に伝達する。この過程で重要な役割を担う減数分裂では、クロマチン修飾がリモデリングされ、それが減数分裂組換え頻度や位置の決定に寄与する。同機構に関連する遺伝子の改変は、優良形質と一緒に劣悪形質遺伝子が導入される「連鎖の引きずり」の解消など、育種効率向上につながる。本課題では、イネの葯における減数分裂染色体のエピゲノム制御に着目し、減数分裂特異的に発現する小分子RNAが体細胞から隣接する生殖細胞に移行し、細胞非自律的にエピゲノム制御に加わる可能性の検証を目的とする。
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| 研究実績の概要 |
イネの葯で減数分裂特異的に発現する小分子RNAを中心とした細胞間シグナル因子による、細胞非自律的な減数分裂染色体のエピゲノム制御機構の解析を目的とする。2021年度は主に以下の3つの成果を得た。
＜1. 小分子RNAと結合するイネAGO4の解析＞ イネAGO4特異的抗体を用いて、AGO4に結合する小分子RNAを網羅的に解読し、減数分裂特異的小分子RNAである24nt phasiRNAのAGO4結合を確認した。また、ゲノム編集技術で作成したago4変異体を利用し、雄性減数分裂細胞（PMCs）を顕微鏡下で分取し、AGO4が減数分裂染色体のDNAメチル化に与える影響を網羅的に解析した。現在、上記2種類のデータについて情報解析を行なっている。
＜2. 細胞壁リプログラミング関連遺伝子の機能解析＞ 減数分裂前後のイネ葯は、PMCsを4層の体細胞層が包み込む構造をとる。減数分裂への移行を境に、PMCsおよびPMCsに接する体細胞層（タペート細胞（TCs））の細胞壁成分は、セルロースからカロースへと変化するが、その生物機能は未解明だった。ゲノム編集技術により、この時期のイネ葯で高発現するカロース合成酵素GSL5の変異体を作成して解析し、GSL5はイネ葯における減数分裂前後のカロース合成の大半を担うことを示した。また、GSL5依存的な葯へのカロース蓄積が、減数分裂の開始と進行における必須の役割を明らかにした。
＜3. 葯室のシン／アポプラスト輸送経路のイメージング解析＞ 植物細胞の細胞間シグナル経路は、原形質連絡を介したシンプラスト経路と、細胞外小胞などを介したアポプラスト経路に大別される。これまでの研究から、減数分裂特異的24nt phasiRNAのPMCs-TCs間シグナル伝達の可能性が示唆されている。2021年度は、イネ葯で透過電子顕微鏡観察を行うための技術を確立することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
イネAGO4の解析について、当初の予定通り、結合する小分子RNAの網羅的な解読、および単離したPMCsなどから抽出したDNAを用いたバイサルファイトシーケンス（BS-seq）法によるメチル化DNA領域の網羅的な同定について、データ取得と一部情報解析を完了することができた。
細胞壁リプログラミング関連遺伝子の機能解析について、ゲノム編集技術で作成したイネgsl5変異体の観察から、減数分裂直前の葯室細胞で生じる細胞壁リプログラミングに伴うカロース高蓄積が、減数分裂の適切な時期での開始、および減数分裂の正常な進行に必須の役割を果たすことを明らかにした。これまで、GSL5依存的に合成されたカロースが減数分裂後の花粉形成に重要であるが、減数分裂には不必要だと考えられており、今回の成果は過去の定説を覆した点で、本成果は当初の予想を上回る重要な発見につながったと考えている。
葯室のシン／アポプラスト輸送経路のイメージング解析では、透過電子顕微鏡観察を実施し、イネ葯室を構成するPMCsおよびTCsの間に、多数の原形質連絡構造を確認することができた。今後、各種イネ変異体を用いて葯室の信号伝達経路を解析していく上での基盤的技術が確立されたと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
イネAGO4の解析で得られたAGO4結合小分子RNA解読データ、および減数分裂期PMCsなどのBS-seqデータについて詳細な情報解析を行い、AGO4が標的とする減数分裂染色体ゲノム領域の特定を目指す。
細胞壁リプログラミング関連遺伝子の機能解析について、減数分裂開始・進行制御に関わることが明らかとなったGSL5カロース合成酵素の発現あるいは活性化を促進する上流因子の解析に着手する。有力な候補のひとつは、減数分裂特異的RNA結合タンパク質MEL2である。mel2変異体ではGSL5発現が有意に低下するとともに、gsl5変異体と同様に葯室へのカロース蓄積が欠損する。もうひとつの候補として、活性酸素（ROS）生成酵素RBOHがある。カロース合成は、植物のストレス応答過程でしばしばROS発現と共役することが知られている。共同研究者から入手したイネrboh変異体は高度の種子不稔性を示すため、減数分裂を含む生殖過程での異常が十分に期待できる。
葯室のシン／アポプラスト輸送経路のイメージング解析では、今年度に確立したイネ葯の透過電子顕微鏡観察技術を用いて、gsl5やmel2、rbohイネ変異体の葯質における原形質連絡の形成頻度などの比較から、シンプラストシグナル伝達経路の雄性減数分裂における役割を解析するためのヒントが得られると期待している。
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