| 研究課題/領域番号 |
21H04959
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
中区分90:人間医工学およびその関連分野
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
遊佐 宏介 京都大学, 医生物学研究所, 教授 (00813180)
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| 研究分担者 |
青木 一成 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (30618020)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
41,730千円 (直接経費: 32,100千円、間接経費: 9,630千円)
2024年度: 10,140千円 (直接経費: 7,800千円、間接経費: 2,340千円)
2023年度: 10,140千円 (直接経費: 7,800千円、間接経費: 2,340千円)
2022年度: 10,140千円 (直接経費: 7,800千円、間接経費: 2,340千円)
2021年度: 11,310千円 (直接経費: 8,700千円、間接経費: 2,610千円)
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| キーワード | CRISPR-Cas9 / 遺伝学的スクリーニング / 白血病 / in vivoモデル / ゲノム編集 / Flp / スクリーニング / T-ALL / MM / Genetic screening / Leukemia / in vivo model / in vivo CRISPRスクリーニング / 多発性骨髄腫 / 増殖必須因子 / 分子標的 / Cre |
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| 研究開始時の研究の概要 |
順遺伝学は網羅的遺伝子探索法として強力な研究手段である。長らく困難であったほ乳類細胞において順遺伝学を実現するため、我々はCRISPR-Cas9システムを応用しCRISPRスクリーニング法を開発した。多くの研究室において実施されてきたが、そのほとんどはin vitro 培養細胞を用いている。生体内での生命現象、特に生体内負の選択は技術的困難を伴う。本研究では、マウスへ移植後、骨髄中で増殖するヒト多発性骨髄腫を解析対象として、負の選択に着目したin vivo CRISPRスクリーニングの技術基盤を開発する。また、ヒト多発性骨髄腫の骨髄内増殖必須遺伝子を同定して、新規治療戦略への応用展開を目指す。
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| 研究実績の概要 |
マウス遺伝学においては時空間特異的遺伝子破壊のために一般的に用いられるCre-loxPシステムであるが、ヒト細胞においては高い細胞毒性が見られ、それはin vitroの培養系でも、ヒト細胞をマウスに移植した後のin vivo環境下でも同様であった。そこで、前年度において毒性のほとんど検出されない代替法として選択したFlp-FRTシステムとCRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集ツールのベクター系の構築を進めている。
ゲノム編集の時空間的制御システムを構築する間に補完的に進めていたT-ALLにおけるCXCR4-CXCL12相互作用にかかわる因子の遺伝学的クリーニングでは、クロマチンリモデリング因子を同定するに至り、研究を進めてきた。前年度までにクロマチンリモデリング因子の阻害剤により転写因子RUNX1のエンハンサー結合が低下しCXCR4の遺伝子発現が低下、CXCL12に対するケモタキシス活性が低下することが明らかとなったが、さらに細胞増殖にかかわる因子の検討を進めCDK6やBCL11B遺伝子エンハンサーへのRUNX1の結合にも当該クロマチンリモデリング因子が必須であることを明らかとした。CDK6に関してはcDNAレスキューにより、クロマチンリモデリング因子阻害剤の効果が一部キャンセルすることから、より直接的に細胞増殖に関与していると考えられた。このクロマチンリモデリング因子阻害は患者由来ゼノグラフトモデルにおいても有効性が確認され、T-ALLの新たな治療戦略になると期待された。以上の結果をBlood誌上にて報告した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Cre-loxPシステムの代替法として、ヒトES細胞での検証結果からFlp-FRTシステムを選択することとし、ゲノム編集を時空間的に制御するためのベクター系の構築を進めている。今後、遺伝子導入細胞を作製し、組換え効率の検証をvitro及びvivoにて実施するが、マウスに移植後高い生着率をもつ細胞株を用いることが重要である。これまでのT細胞急性リンパ球性白血病及び多発性骨髄腫細胞株を用いた移植実験の結果から、生着率が高いと考えられる細胞株を複数見出すことができた。今後、これらの細胞株を用いてベクターの導入、正確な正着クローン数の検証を進める。
In vivoで使用するシステム開発と並行して、多発性骨髄腫が骨髄にとどまる機構の一つCXCR4-CXCL12の相互作用に着目したゲノムワイドCRISPRスクリーニングを実施し研究を進めてきた。同定された因子の一つクロマチン制御因子の分子メカニズム解析を、CXCR4-CXCL12相互作用の観点からCXCR4遺伝子の発現制御、さらに細胞増殖の観点からCDK6とBCL11B遺伝子の発現制御において明らかとし、また、細胞株及び患者由来ゼノグラフトモデルを使ったin vivoでの阻害剤実験においてもCXCR4やCDK6の発現低下を確認することができた。ここまでの結果をBlood誌で発表した。引き続き、本阻害剤の薬効にかかわる因子の同定をCRIPSRスクリーニングで実施し、いくつかの興味深い候補遺伝子が得られているので、検証を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
FlpERT2発現ユニット、FRT-STOP-FRT-Cas9発現ユニットを組み込んだ骨髄腫細胞あるいは白血病細胞を用いて、vitroでのゲノム編集活性の確認、マウス移植後のvivoでの時空間的誘導及びゲノム編集活性の検証を進める。白血病の治療標的として同定したクロマチンリモデリング因子をコードする遺伝子や、CXCR4遺伝子そのものをモデルケースとして、vivoでのゲノム編集による遺伝子不活化が、どのような細胞の表現型に結びつくのかを検証し、vivoスクリーニングにおける適切な処理時間の算出を行う。また、スクリーニングを行う上で重要なのが、ライブラリーに含まれるガイドRNAの総数に対するカバー率であり、これまでのマウス移植実験から生着率の良好な細胞株を選定する事ができ、これらの細胞株は高いカバー率を示すと期待される。より正確に各細胞株の生着率を計測するため、生着細胞数の検証をバーコーディング技術を用いて実施し、in vivoスクリーニングに適した細胞株の選定を進める。
新たに白血病の治療標的として同定したクロマチンリモデリング因子に関しては、阻害剤の薬効に影響を与える因子候補をCRISPRスクリーニングにより得たので、これら候補因子の作用機序を解析し、クロマチンリモデリング因子と協調的に機能する因子の同定、またその阻害剤を用いたより高い抗腫瘍効果の検証を進める。当該クロマチンリモデリング因子の阻害は多発性骨髄腫においても薬効があるとの報告があることから、多発性骨髄腫における遺伝子制御機構の解析も実施する。
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