| 研究課題/領域番号 |
21H05028
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| 研究種目 |
基盤研究(S)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
大区分E
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
梶原 康宏 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (50275020)
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| 研究分担者 |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 教授 (20423973)
佐藤 あやの 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 准教授 (40303002)
和泉 雅之 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (80332641)
川本 晃大 大阪大学, 蛋白質研究所, 助教 (90631523)
岡本 亮 成蹊大学, 理工学部, 准教授 (30596870)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2024年度)
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| 配分額 *注記 |
189,670千円 (直接経費: 145,900千円、間接経費: 43,770千円)
2024年度: 35,230千円 (直接経費: 27,100千円、間接経費: 8,130千円)
2023年度: 35,230千円 (直接経費: 27,100千円、間接経費: 8,130千円)
2022年度: 35,230千円 (直接経費: 27,100千円、間接経費: 8,130千円)
2021年度: 48,750千円 (直接経費: 37,500千円、間接経費: 11,250千円)
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| キーワード | 糖鎖 / タンパク質 / 糖タンパク質 / 水和水 / チオアシッド / メルカプトアミノ酸 / 糖ペプチド / 水和 / 糖鎖水和殻 / CryoEM / 膜貫通型糖タンパク質 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、単一構造の糖鎖をもつ糖タンパク質を短工程で合成できる新規法の確立を目指す。そして、その糖鎖を自在に換えて糖タンパク質の物理化学的性質や水との相互作用能力の変化、およびタンパク質間相互作用への影響を調べる。また、生細胞上での膜１回貫通型糖タンパク質の合成ならびに細胞表層での動的挙動を追跡する。さらには、合成糖タンパク質プローブを細胞内のゴルジ体へ挿入し、そこを始点とする糖鎖生合成の追跡、CryoEMによる合成糖タンパク質―受容体複合体の構造解析を検討する。これら実験により、合成法も含め糖鎖、タンパク質の機能を理解する世界的に例のない統合的アプローチを実施する。
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| 研究実績の概要 |
ヒトのSPINK13という抗がん作用を示す糖タンパク質の合成を試みた。SPINK13はPro-Asn(Glycan)-Val-Thrという非常に嵩高いアミノ酸の間に糖鎖アスパラギンを持っているが、H2N-Asn(Glycan)COSHから5工程でフォールディングした天然型のSPINK13を合成することに成功した。また、抗がん作用を調べたところ、糖鎖がないSPINK13が正常細胞への癌細胞の浸潤を阻害することが明らかとなった。昨年度までに確立したβSHアミノ酸を合成する方法を利用し、アルギニン、リジン、ヒスチジン、トリプトファンの合成、及びキラルカラムによる光学分割に成功した。また、PdによるCH活性化法をもとにγ位にチオールをもつイソロイシン、バリン、トレオニンの合成も確立した。糖鎖をもつ合成EPOおよび、大腸菌で発現し、高度に精製したEPOと、市販のEPOのレセプターとの結合親和力を表面プラズモン共鳴法(SPR)で調べた。その結果、糖鎖化EPOの方が僅かに親和力が高いことが明らかになった。次に糖鎖と水の相互作用を、NMRを用いて調べたところ、NOEが強く観測されたことから、糖鎖構造特異的な水和の生成が示唆された。また、新規なNMR測定法で、糖鎖と水の相互作用を追跡する方法を確立した。糖タンパク質ICOSの膜貫通部分に相当するペプチド配列を、故意に糖鎖付加したスプリットInteinBと連結させたペプチド（InteinB-ICOS）を細胞表層に発現することに成功した。そして、糖鎖化InteinB-ICOSを細胞に発現後、細胞を均一液化した溶液中でProteinA-InteinAを加え、ProteinA-ProteinBが得られることを確認した。現在、合成した糖タンパク質ICOSをinteinAを利用して導入することを検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
一連のβメルカプトアミノ酸の合成および糖タンパク質の合成が当初の計画通り完了した。糖鎖と水の相互作用を追跡する新規な測定法を確立した。糖鎖の水溶性を利用する新規糖タンパク質の合成法を見出した。
細胞表層への糖タンパク質導入に目処を立てることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
チオアシッドを利用する糖タンパク質の合成例をさらに増やし糖鎖機能解明の研究を展開する。
糖鎖、糖タンパク質と水の相互作用を追跡し、糖鎖がタンパク質間相互作用時にどのような機能を果たしているか調べる。
インテインを使った細胞表層への糖タンパク質の導入法を検討する。
CryoEM を利用する糖タンパク質の構造解析、特にデータの精密化をおこなう。
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| 評価記号 |
中間評価所見 (区分)
A: 研究領域の設定目的に照らして、期待どおりの進展が認められる
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