生体環境でのGPCRの構造ダイナミクス

• 研究課題/領域番号: 21H05037
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 大区分G
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 濡木 理 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (10272460)
• 研究分担者: 小笠原 諭 千葉大学, 大学院理学研究院, 准教授 (30546685) ; 井上 飛鳥 東北大学, 薬学研究科, 教授 (50525813) ; 藤芳 暁 東京工業大学, 理学院, 助教 (70371705)
• 研究期間 (年度): 2021-07-05 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 189,280千円 (直接経費: 145,600千円、間接経費: 43,680千円); 2025年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2024年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2023年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2022年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2021年度: 42,120千円 (直接経費: 32,400千円、間接経費: 9,720千円)
• キーワード: GPCR / 生体膜 / クライオ電子顕微鏡

研究開始時の研究の概要

GPCRは7回膜貫通型の細胞膜に存在する蛋白質であり、化学物質など外界からの刺激を受容し細胞内にシグナルを伝達する。本研究では、生体膜環境に近い状態に再構成したGPCRの構造をクライオ電子顕微鏡法によって決定し、さらにクライオ蛍光顕微鏡やトモグラフィーを駆使することで、GPCRがどのように細胞にシグナルを伝えているのかを生の状態で可視化する。構造情報を元に、GPCRの活性を操る新規薬剤の開発につなげる。

研究実績の概要

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかの解明を目的としている。特に、交感神経を司るβアドレナリン受容体のうち、β1とβ2受容体は2007年頃の最初期に構造が決定されたGPCR研究のファーストランナーだったが、それから14年もの間、β3受容体の構造だけは報告されていなかった。そこで我々はヒトではなくイヌ由来β3受容体が構造解析に最適であることを見出し、過活動膀胱治療薬ミラベグロンが結合した構造を報告し、薬剤の選択性の分子基盤を明らかにできた。PTH1Rについては、PTH結合型とPTHrP結合型のPTH1Rの構造をCryo-EMで決定し、比較することで、リガンドとレセプターの相互作用の違いやリガンドの親和性や選択性の違いを明らかにした。
PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明した。
また個々のGPCR構造解析だけではなく、周辺の要素技術の開発も進んでおり、これは当初の想定以上の成果である。まず、簡便なナノディスク再構成法が開発され、これによりオンカラムで迅速かつ高純度に膜タンパク質の精製が可能になった。また、オンカラム中で高効率にナノディスク化した膜タンパク質の精製プロトコルが確立され、これにより従来の方法よりも迅速かつ効率的な解析が可能になった

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかを解明した。これらの業績を代表研究者濡木がラストオーサーとして、2022-2023年度にNature, Science誌を含む8報の論文としてまとめており、卓越した研究成果をあげているといえる。特にPTH1Rについては、PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明し、これらの成果をmolecular cell誌に発表した。PTH1Rに結合するアゴニストとの複合体の構造機能解析に成功し、細胞内側に結合するバイアスアゴニストPCO371の作用機構を明らかにし、Natureに掲載された。これにより、特定のシグナル伝達経路を優先的に調節する方法が提案された。また、βアレスチンは7回膜貫通型受容体（7TMR）のシグナル伝達と制御に関与する多機能タンパク質であり、その相互作用は主にアゴニストによる受容体の活性化とリン酸化によって駆動される。我々はアレスチンの基底状態、細胞内第3ループを介したムスカリン受容体サブタイプ2（M2R）による活性化、あるいはアレスチンに偏ったデコイD6受容体（D6R）による活性型の7つの低温電子顕微鏡構造を決定しscience誌に報告した。生化学的、細胞学的、生物物理学的実験と組み合わせることで、アレスチンと7TMRの非典型的な結合様式を明らかにした。

今後の研究の推進方策

今後は、標的GPCRのナノディスク環境での複合体の構造を網羅的に解析し、界面活性剤環境下との構造や構造多型の違いを解析する。特筆すべき点は、界面活性剤環境下で観察されたPTH1Rの構造多型がナノディスク環境でも観察されるかや、脂質受容体の場合内在性脂質アゴニストのセカンダリー結合サイトが存在するか、等である。ナノディスク環境出られたGPCR構造を元に分担者の井上飛鳥教授と共同で機能解析を行い、構造から得られた知見を実証する。さらに、ナノディスクを用いたβアレスチンとGPCRの複合体の構造解析を行い、薬剤によって受容体がGタンパク質を活性化するか、アレスチンを活性化するかというバイアスを理解し副作用の少ない創薬を目指す。アレスチンは脂質と相互作用するため、ナノディスクによる構造解析によって生理的な構造を得られる可能性が高い。まずリゾフォスファチジル酸受容体LPA1とβアレスチンとの複合体の構造解析を行う。脂質受容体ヘテロダイマーについては生理的な機能なども不明であり、共役するGタンパク質も分からない状況にあるため、まずはヘテロダイマーの精製産物を用いて共役するGタンパク質をin vitroで探索する。分担者の井上飛鳥と共同で、細胞アッセイによってLPA1とS1P1共発現による機能への影響も検証する。さらに、Gタンパク質との複合体の再構成系の構築に取り組み、最終的には精製産物を用いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を実施し、ヘテロダイマーの構造情報取得を目指す。

評価記号

中間評価所見 (区分)

A+: 研究領域の設定目的に照らして、期待以上の進展が認められる

研究成果

• [雑誌論文] Optimizing cryo-EM structural analysis of Gi-coupling receptors via engineered Gt and Nb35 application (2024)
  • 著者名/発表者名: Hidetaka S Oshima, Fumiya K Sano, Hiroaki Akasaka, Aika Iwama, Wataru Shihoya, Osamu Nureki
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun 巻: 693 ページ: 149361-149361
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2023.149361
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Molecular insights into atypical modes of β-arrestin interaction with seven transmembrane receptors (2024)
  • 著者名/発表者名: Jagannath Maharana , Fumiya K Sano , Parishmita Sarma , Manish K Yadav, Longhan Duan , Tomasz M Stepniewski , Madhu Chaturvedi, Ashutosh Ranjan, Vinay Singh , Sayantan Saha , Gargi Mahajan , Mohamed Chami , Wataru Shihoya , Jana Selent , Ka Young Chung , Ramanuj Banerjee , Osamu Nureki , Arun K Shukla
  • 雑誌名: Science 巻: 383 号: 6678 ページ: 101-108
  • DOI: 10.1126/science.adj3347
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis for lysophosphatidylserine recognition by GPR34 (2024)
  • 著者名/発表者名: Izume Tamaki、Kawahara Ryo、Uwamizu Akiharu、Chen Luying、Yaginuma Shun、Omi Jumpei、Kawana Hiroki、Hou Fengjue、Sano Fumiya K.、Tanaka Tatsuki、Kobayashi Kazuhiro、Okamoto Hiroyuki H.、Kise Yoshiaki、Ohwada Tomohiko、Aoki Junken、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 15 号: 1 ページ: 902-902
  • DOI: 10.1038/s41467-024-45046-z
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Class B1 GPCR activation by an intracellular agonist (2023)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Tomita Atsuhiro、Nishimura Michihiro、Sawada Kazuhiro、Okamoto Hiroyuki H.、Hiratsuka Suzune、Nakamura Gaku、Kuwabara Riku、Noda Hiroshi、Muramatsu Hiroyasu、Shimizu Masaru、Taguchi Tomohiko、Inoue Asuka、Murata Takeshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature 巻: 618 号: 7967 ページ: 1085-1093
  • DOI: 10.1038/s41586-023-06169-3
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structural Insights into Endothelin Receptor Signaling (2023)
  • 著者名/発表者名: Shihoya, Wataru, Sano, Fumiya K, Nureki, Osamu,
  • 雑誌名: J Biochem, 巻: 29 号: 4 ページ: 317-325
  • DOI: 10.1093/jb/mvad055
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Phototrophy by Antenna-Containing Rhodopsin Pumps in Aquatic Environments (2023)
  • 著者名/発表者名: Chazan, Das, Fujiwara, Murakoshi, Rozenberg, Molina-Marquez, Sano, Tanaka, Gomez-Villegas, Larom, Pushkarev, Malakar, Hasegawa, Tsukamoto, Ishizuka, Konno, Nagata, Mizuno, Katayama, Abe-Yoshizumi, Ruhman, Inoue, Kandori, Leon, Shihoya, Yoshizawa, Sheves, Nureki, Beja
  • 雑誌名: Nature 巻: 615 号: 7952 ページ: 535-540
  • DOI: 10.1038/s41586-023-05774-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Lateral access mechanism of LPA receptor probed by molecular dynamics simulation. (2022)
  • 著者名/発表者名: Suenaga R, Takemoto M, Inoue A, Ishitani R＊, Nureki O＊
  • 雑誌名: PLoS. One. 巻: 17 号: 2 ページ: e0263296-e0263296
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0263296
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of the β3 adrenergic receptor bound to solabegron and isoproterenol (2022)
  • 著者名/発表者名: Nureki Ikko、Kobayashi Kazuhiro、Tanaka Tatsuki、Demura Kanae、Inoue Asuka、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 611 ページ: 158-164
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.04.065
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Miyauchi Hirotake、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Shihoya Wataru、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kato Hideaki E.、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 18 ページ: 3468-3483
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.07.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pharmacophore-guided Virtual Screening to Identify New β3 -adrenergic Receptor Agonists (2022)
  • 著者名/発表者名: Ujiantari NSO, 他 3 名, Nureki O(5 番目), Hutchinson DS, Schuster D
  • 雑誌名: Mol. Inform. 巻: 41 号: 7 ページ: 2100223-2100223
  • DOI: 10.1002/minf.202100223
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Cell-Free Synthesis of Human Endothelin Receptors and Its Application to Ribosome Display (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakai Hiroki、Isshiki Kinuka、Hattori Masato、Maehira Hiromasa、Yamaguchi Tatsumi、Masuda Keiko、Shimizu Yoshihiro、Watanabe Takayoshi、Hohsaka Takahiro、Shihoya Wataru、Nureki Osamu、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime、Matsuura Tomoaki
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 94 号: 9 ページ: 3831-3839
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.1c04714
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme (2022)
  • 著者名/発表者名: Kurihara Nina、Nakagawa Ryoya、Hirano Hisato、Okazaki Sae、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Scott David A.、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 10 ページ: 1865-1877
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of thylakoid-located voltage-dependent chloride channel VCCN1 (2022)
  • 著者名/発表者名: Hagino Tatsuya、Kato Takafumi、Kasuya Go、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Hamamoto Shin、Sobajima Tomoaki、Fujiwara Yuichiro、Yamashita Keitaro、Kawasaki Hisashi、Maturana Andr?s D.、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 2505-2505
  • DOI: 10.1038/s41467-022-30292-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure of the Dicer-2-R2D2 heterodimer bound to a small RNA duplex (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Sonomi、Naganuma Masahiro、Nishizawa Tomohiro、Kusakizako Tsukasa、Tomari Yukihide、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature 巻: 607 号: 7918 ページ: 393-398
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04790-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural insights into inhibitory mechanism of human excitatory amino acid transporter EAAT2 (2022)
  • 著者名/発表者名: Kato Takafumi、Kusakizako Tsukasa、Jin Chunhuan、Zhou Xinyu、Ohgaki Ryuichi、Quan LiLi、Xu Minhui、Okuda Suguru、Kobayashi Kan、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kanai Yoshikatsu、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 4714-4714
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32442-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure and engineering of the minimal type VI CRISPR-Cas13bt3 (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Ryoya、Kannan Soumya、Altae-Tran Han、Takeda Satoru N.、Tomita Atsuhiro、Hirano Hisato、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Zhang Feng、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 17 ページ: 3178-3192
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.08.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of the active Gi-coupled human lysophosphatidic acid receptor 1 complexed with a potent agonist (2022)
  • 著者名/発表者名: Akasaka Hiroaki、Tanaka Tatsuki、Sano Fumiya K.、Matsuzaki Yuma、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-022-33121-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of thermostabilized prestin provide mechanistic insights underlying outer hair cell electromotility (2022)
  • 著者名/発表者名: Futamata Haon、Fukuda Masahiro、Umeda Rie、Yamashita Keitaro、Tomita Atsuhiro、Takahashi Satoe、Shikakura Takafumi、Hayashi Shigehiko、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Homma Kazuaki、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 6208-6208
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34017-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagiri, C., Kobayashi, K., Tomita, A., Kato, M., Kobayashi, K., Yamashita, K., Nishizawa, T., Inoue, A., Shihoya, W. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 81 号: 15 ページ: 3205-3215
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM structure of the human MT1-Gi signaling complex. (2021)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, H. H., Miyauchi, H., Inoue, A., Raimondi, F., Tsujimoto, H., Kusakizako, T., Shihoya, W., Yamashita, K., Suno, R., Nomura, N., Kobayashi, T., Iwata, S., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol. 巻: 28 号: 8 ページ: 694-701
  • DOI: 10.1038/s41594-021-00634-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis of gating modulation of Kv4 channel complexes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kise Y, Kasuya G, Okamoto HH, Yamanouchi D, Kobayashi K, Kusakizako T, Nishizawa T, Nakajo K, Nureki O.
  • 雑誌名: Nature 巻: 599 号: 7883 ページ: 158-164
  • DOI: 10.1038/s41586-021-03935-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM reveals mechanistic insights into lipid-facilitated polyamine export by human ATP13A2. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tomita, A., Daiho, T., Kusakizako, T., Yamashita, K., Ogasawara, S., Murata, T., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 81 号: 23 ページ: 4799-4809
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.11.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Bridging membrane proteins to RNA (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: SFD Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural Biology of Membrane Proteins; Channels, Transporters and GPCRs (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: iMC Bio seminar
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] アカデミアとベンチャーの連携による、膜タンパク質およびRNA・タンパク質複合体を標的とした立体構造に基づくドラッグデザインと遺伝子治療 (2023)
  • 著者名/発表者名: 濡木理
  • 学会等名: CBIセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] Physiological dynamics of GPCR and structural-based drug design (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: Cryo-EM Conference IIT
  • 招待講演
• [学会発表] Dynamics of Class B GPCRs (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: GPCR Workshop 2023
• [学会発表] Transporters and Channels Maintain the Plant Homeostasis in/by Photosynthesis” Osamu Nureki (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: IWPMB2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural Basis for the Mechanisms of Wide Substrate Specificity and Their Transport of a ABC transporter (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: Gordon Research Conference ;Targeting the Mechanisms and Regulation of Transporters for Advancing Health During a Pandemic
  • 国際学会
• [学会発表] Structural basis for moleculer mechanisms of P4 flippase and P5 polyamine transporter (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: Symposium on Membrane protein Production and Analysis
  • 国際学会
• [学会発表] “Structural basis for molecular mechanisms of CRISPR-Cas and development of novel genome-editing tools towards gene therapy” “Functional dynamics of membrane transporter and receptor” (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 19h Course of the International School for Biological Magnetic Resonance
• [学会発表] Cryo-EM structures elucidate the lipid transport cycle of the P4-ATPase flipase (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 16th International Conference on Na,K-ATPase and related Transport ATPases
  • 国際学会
• [学会発表] 膜タンパク質と非翻訳 RNA の分子機構の構造基盤 (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 生物物理学会
  • 国際学会
• [学会発表] Time-resolved serial femtosecond crystal of channeldopsin and design of novel optogenetics tools (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 19th International Conference on Retinal Proteins
  • 国際学会
• [図書] 医学のあゆみ (2021)
  • 著者名/発表者名: 志甫谷渉・濡木理
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 医歯薬出版
  • ISBN: 2105578160
• [産業財産権] Engineered small Cas13bt3 with enhanced activity (2022)
  • 発明者名: 濡木理、西増弘志、中川綾哉
  • 権利者名: 国立大学法人東京大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2022
  • 外国
• [産業財産権] 膜タンパク質のC末端に付加した His-tag に 対する高親和性モノクローナル抗体 (cHis8) (2022)
  • 発明者名: 小笠原 諭、村田 武士
  • 権利者名: 国立大学法人千葉大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2022
  • 取得年月日: 2022
• [学会・シンポジウム開催] SFD Conference (2023)
• [学会・シンポジウム開催] GPCR Workshop 2023 (2023)