生体環境でのGPCRの構造ダイナミクス

• 研究課題/領域番号: 21H05037
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 配分区分: 補助金
• 審査区分: 大区分G
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 濡木 理 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (10272460)
• 研究分担者: 小笠原 諭 千葉大学, 大学院理学研究院, 准教授 (30546685) ; 井上 飛鳥 東北大学, 薬学研究科, 教授 (50525813) ; 藤芳 暁 東京工業大学, 理学院, 助教 (70371705)
• 研究期間 (年度): 2021-07-05 – 2026-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2024年度)
• 配分額: 189,280千円 (直接経費: 145,600千円、間接経費: 43,680千円); 2024年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2023年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2022年度: 36,790千円 (直接経費: 28,300千円、間接経費: 8,490千円); 2021年度: 42,120千円 (直接経費: 32,400千円、間接経費: 9,720千円)
• キーワード: GPCR / 生体膜 / クライオ電子顕微鏡

研究開始時の研究の概要

GPCRは7回膜貫通型の細胞膜に存在する蛋白質であり、化学物質など外界からの刺激を受容し細胞内にシグナルを伝達する。本研究では、生体膜環境に近い状態に再構成したGPCRの構造をクライオ電子顕微鏡法によって決定し、さらにクライオ蛍光顕微鏡やトモグラフィーを駆使することで、GPCRがどのように細胞にシグナルを伝えているのかを生の状態で可視化する。構造情報を元に、GPCRの活性を操る新規薬剤の開発につなげる。

研究実績の概要

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかの解明を目的としている。特に、交感神経を司るβアドレナリン受容体のうち、β1とβ2受容体は2007年頃の最初期に構造が決定されたGPCR研究のファーストランナーだったが、それから14年もの間、β3受容体の構造だけは報告されていなかった。そこで我々はヒトではなくイヌ由来β3受容体が構造解析に最適であることを見出し、過活動膀胱治療薬ミラベグロンが結合した構造を報告し、薬剤の選択性の分子基盤を明らかにできた。PTH1Rについては、PTH結合型とPTHrP結合型のPTH1Rの構造をCryo-EMで決定し、比較することで、リガンドとレセプターの相互作用の違いやリガンドの親和性や選択性の違いを明らかにした。PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明した。
また個々のGPCR構造解析だけではなく、周辺の要素技術の開発も進んでおり、これは当初の想定以上の成果である。まず、簡便なナノディスク再構成法が開発され、これによりオンカラムで迅速かつ高純度に膜タンパク質の精製が可能になった。また、オンカラム中で高効率にナノディスク化した膜タンパク質の精製プロトコルが確立され、これにより従来の方法よりも迅速かつ効率的な解析が可能になった。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかを解明した。これらの業績を代表研究者濡木がラストオーサーとして、Nature誌を含む7報の論文としてまとめており、卓越した研究成果をあげているといえる。特に、交感神経を司るβアドレナリン受容体のうち、β1とβ2受容体は2007年頃の最初期に構造が決定されたGPCR研究のファーストランナーだったが、それから14年もの間、β3受容体の構造だけは報告されていなかった。そこで我々はヒトではなくイヌ由来β3受容体が構造解析に最適であることを見出し、過活動膀胱治療薬ミラベグロンが結合した構造を報告し、薬剤の選択性の分子基盤を明らかにできた。PTH1Rについては、・PTH結合型とPTHrP結合型のPTH1Rの構造をCryo-EMで決定し、比較することで、リガンドとレセプターの相互作用の違いやリガンドの親和性や選択性の違いを明らかにした。
PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明した。
PTH1Rに結合するアゴニストとの複合体の構造機能解析に成功し、細胞内側に結合するバイアスアゴニストPCO371の作用機構を明らかにした。これにより、特定のシグナル伝達経路を優先的に調節する方法が提案された。

今後の研究の推進方策

今後は、標的GPCRのナノディスク環境での複合体の構造を網羅的に解析し、界面活性剤環境下との構造や構造多型の違いを解析する。特筆すべき点は、界面活性剤環境下で観察されたPTH1Rの構造多型がナノディスク環境でも観察されるかや、脂質受容体の場合内在性脂質アゴニストのセカンダリー結合サイトが存在するか、等である。計画に含んでいた、唯一の機械刺激受容体GPCRであるGPR68の構造解析にも取り組む。機械刺激膜蛋白質は脂質との相互作用が活性化に重要であり、脂質構成によって活性が大きく変わるため、GPR68を様々な組成の脂質を用いてナノディスクに再構成し、Gq蛋白質との複合体形成能を網羅的に検討する。複合体が形成できた場合は、Cryo-EMを用いて構造解析を行い、機械刺激によるGPR68の活性化機構を解明する。ナノディスク環境出られたGPCR構造を元に分担者の井上飛鳥教授と共同で機能解析を行い、構造から得られた知見を実証する。
脂質受容体ヘテロダイマーについては生理的な機能なども不明であり、共役するGタンパク質も分からない状況にあるため、まずはヘテロダイマーの精製産物を用いて共役するGタンパク質をin vitroで探索する。分担者の井上飛鳥と共同で、細胞アッセイによってLPA1とS1P1共発現による機能への影響も検証する。さらに、Gタンパク質との複合体の再構成系の構築に取り組み、最終的には精製産物を用いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を実施し、ヘテロダイマーの構造情報取得を目指す。

評価記号

中間評価所見 (区分)

A+: 研究領域の設定目的に照らして、期待以上の進展が認められる

研究成果

• [雑誌論文] Phototrophy by Antenna-Containing Rhodopsin Pumps in Aquatic Environments (2023)
  • 著者名/発表者名: Chazan, Das, Fujiwara, Murakoshi, Rozenberg, Molina-Marquez, Sano, Tanaka, Gomez-Villegas, Larom, Pushkarev, Malakar, Hasegawa, Tsukamoto, Ishizuka, Konno, Nagata, Mizuno, Katayama, Abe-Yoshizumi, Ruhman, Inoue, Kandori, Leon, Shihoya, Yoshizawa, Sheves, Nureki, Beja
  • 雑誌名: Nature 巻: 615 号: 7952 ページ: 535-540
  • DOI: 10.1038/s41586-023-05774-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Lateral access mechanism of LPA receptor probed by molecular dynamics simulation. (2022)
  • 著者名/発表者名: Suenaga R, Takemoto M, Inoue A, Ishitani R＊, Nureki O＊
  • 雑誌名: PLoS. One. 巻: 17 号: 2 ページ: e0263296-e0263296
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0263296
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of the β3 adrenergic receptor bound to solabegron and isoproterenol (2022)
  • 著者名/発表者名: Nureki Ikko、Kobayashi Kazuhiro、Tanaka Tatsuki、Demura Kanae、Inoue Asuka、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 611 ページ: 158-164
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.04.065
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Miyauchi Hirotake、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Shihoya Wataru、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kato Hideaki E.、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 18 ページ: 3468-3483
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.07.003
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Pharmacophore-guided Virtual Screening to Identify New β3 -adrenergic Receptor Agonists (2022)
  • 著者名/発表者名: Ujiantari NSO, 他 3 名, Nureki O(5 番目), Hutchinson DS, Schuster D
  • 雑誌名: Mol. Inform. 巻: 41 号: 7
  • DOI: 10.1002/minf.202100223
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cell-Free Synthesis of Human Endothelin Receptors and Its Application to Ribosome Display (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakai Hiroki、Isshiki Kinuka、Hattori Masato、Maehira Hiromasa、Yamaguchi Tatsumi、Masuda Keiko、Shimizu Yoshihiro、Watanabe Takayoshi、Hohsaka Takahiro、Shihoya Wataru、Nureki Osamu、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime、Matsuura Tomoaki
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 94 号: 9 ページ: 3831-3839
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.1c04714
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme (2022)
  • 著者名/発表者名: Kurihara Nina、Nakagawa Ryoya、Hirano Hisato、Okazaki Sae、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Scott David A.、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 10 ページ: 1865-1877
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of thylakoid-located voltage-dependent chloride channel VCCN1 (2022)
  • 著者名/発表者名: Hagino Tatsuya、Kato Takafumi、Kasuya Go、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Hamamoto Shin、Sobajima Tomoaki、Fujiwara Yuichiro、Yamashita Keitaro、Kawasaki Hisashi、Maturana Andr?s D.、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 2505-2505
  • DOI: 10.1038/s41467-022-30292-w
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structure of the Dicer-2-R2D2 heterodimer bound to a small RNA duplex (2022)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi Sonomi、Naganuma Masahiro、Nishizawa Tomohiro、Kusakizako Tsukasa、Tomari Yukihide、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature 巻: 607 号: 7918 ページ: 393-398
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04790-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural insights into inhibitory mechanism of human excitatory amino acid transporter EAAT2 (2022)
  • 著者名/発表者名: Kato Takafumi、Kusakizako Tsukasa、Jin Chunhuan、Zhou Xinyu、Ohgaki Ryuichi、Quan LiLi、Xu Minhui、Okuda Suguru、Kobayashi Kan、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kanai Yoshikatsu、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 4714-4714
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32442-6
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure and engineering of the minimal type VI CRISPR-Cas13bt3 (2022)
  • 著者名/発表者名: Nakagawa Ryoya、Kannan Soumya、Altae-Tran Han、Takeda Satoru N.、Tomita Atsuhiro、Hirano Hisato、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Zhang Feng、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 82 号: 17 ページ: 3178-3192
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.08.001
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of the active Gi-coupled human lysophosphatidic acid receptor 1 complexed with a potent agonist (2022)
  • 著者名/発表者名: Akasaka Hiroaki、Tanaka Tatsuki、Sano Fumiya K.、Matsuzaki Yuma、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-022-33121-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM structures of thermostabilized prestin provide mechanistic insights underlying outer hair cell electromotility (2022)
  • 著者名/発表者名: Futamata Haon、Fukuda Masahiro、Umeda Rie、Yamashita Keitaro、Tomita Atsuhiro、Takahashi Satoe、Shikakura Takafumi、Hayashi Shigehiko、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Homma Kazuaki、Nureki Osamu
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 13 号: 1 ページ: 6208-6208
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34017-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity. (2021)
  • 著者名/発表者名: Nagiri, C., Kobayashi, K., Tomita, A., Kato, M., Kobayashi, K., Yamashita, K., Nishizawa, T., Inoue, A., Shihoya, W. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 81 号: 15 ページ: 3205-3215
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM structure of the human MT1-Gi signaling complex. (2021)
  • 著者名/発表者名: Okamoto, H. H., Miyauchi, H., Inoue, A., Raimondi, F., Tsujimoto, H., Kusakizako, T., Shihoya, W., Yamashita, K., Suno, R., Nomura, N., Kobayashi, T., Iwata, S., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Nat. Struct. Mol. Biol. 巻: 28 号: 8 ページ: 694-701
  • DOI: 10.1038/s41594-021-00634-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Structural basis of gating modulation of Kv4 channel complexes. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kise Y, Kasuya G, Okamoto HH, Yamanouchi D, Kobayashi K, Kusakizako T, Nishizawa T, Nakajo K, Nureki O.
  • 雑誌名: Nature 巻: 599 号: 7883 ページ: 158-164
  • DOI: 10.1038/s41586-021-03935-z
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Cryo-EM reveals mechanistic insights into lipid-facilitated polyamine export by human ATP13A2. (2021)
  • 著者名/発表者名: Tomita, A., Daiho, T., Kusakizako, T., Yamashita, K., Ogasawara, S., Murata, T., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • 雑誌名: Mol. Cell 巻: 81 号: 23 ページ: 4799-4809
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.11.001
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Dynamics of Class B GPCRs (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: GPCR Workshop 2023
• [学会発表] Transporters and Channels Maintain the Plant Homeostasis in/by Photosynthesis” Osamu Nureki (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: IWPMB2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural Basis for the Mechanisms of Wide Substrate Specificity and Their Transport of a ABC transporter (2023)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: Gordon Research Conference ;Targeting the Mechanisms and Regulation of Transporters for Advancing Health During a Pandemic
  • 国際学会
• [学会発表] Structural basis for moleculer mechanisms of P4 flippase and P5 polyamine transporter (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: Symposium on Membrane protein Production and Analysis
  • 国際学会
• [学会発表] “Structural basis for molecular mechanisms of CRISPR-Cas and development of novel genome-editing tools towards gene therapy” “Functional dynamics of membrane transporter and receptor” (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 19h Course of the International School for Biological Magnetic Resonance
• [学会発表] Cryo-EM structures elucidate the lipid transport cycle of the P4-ATPase flipase (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 16th International Conference on Na,K-ATPase and related Transport ATPases
  • 国際学会
• [学会発表] 膜タンパク質と非翻訳 RNA の分子機構の構造基盤 (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 生物物理学会
  • 国際学会
• [学会発表] Time-resolved serial femtosecond crystal of channeldopsin and design of novel optogenetics tools (2022)
  • 著者名/発表者名: Osamu Nureki
  • 学会等名: 19th International Conference on Retinal Proteins
  • 国際学会
• [図書] 医学のあゆみ (2021)
  • 著者名/発表者名: 志甫谷渉・濡木理
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 医歯薬出版
  • ISBN: 2105578160
• [産業財産権] Engineered small Cas13bt3 with enhanced activity (2022)
  • 発明者名: 濡木理、西増弘志、中川綾哉
  • 権利者名: 国立大学法人東京大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2022
  • 外国
• [産業財産権] 膜タンパク質のC末端に付加した His-tag に 対する高親和性モノクローナル抗体 (cHis8) (2022)
  • 発明者名: 小笠原 諭、村田 武士
  • 権利者名: 国立大学法人千葉大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2022
  • 取得年月日: 2022
• [学会・シンポジウム開催] GPCR Workshop 2023 (2023)