| 研究課題/領域番号 |
21J12274
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| 研究種目 |
特別研究員奨励費
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 国内 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
亀村 興輔 広島大学, 統合生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2022年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2021年度: 900千円 (直接経費: 900千円)
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| キーワード | VAP / 膜タンパク質 / トポロジー / 細胞生物学 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
膜タンパク質は生体膜上で常に一定のトポロジーを取ると信じられてきたが、近年、トポロジーが変化することで膜タンパク質の機能が切り替わる例が報告されている。例えば、細胞環境に応じてCCケモカイン受容体（GPCRの１つ）のトポロジーが変化し、リガンド応答性が調節されることが示された。このようにトポロジー変化の機能的重要性に注目が集まっている。しかし、膜タンパク質のトポロジー変化は、従来の膜タンパク質に関するドグマに反する概念であるため研究が進んでいない。本研究は、膜タンパク質のトポロジー変化制御機構及びその生理的意義を解明することを目的とする。
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| 研究実績の概要 |
細胞内でVAPがトポロジーを変化させる場所を特定するために、S2細胞での金コロイド免疫電子顕微鏡を用いた観察を行った。その結果、VAPは小胞体膜上でN末を細胞質側に向けていた。一方、細胞膜上では多くのVAPがN末を細胞外に向けていた。よって、VAPの大部分は細胞膜上でトポロジー変化している可能性が示唆された。
次に、VAPと同じⅡ型膜タンパク質であるNeurotactin、Star、Sec61βのトポロジー状態を、フローサイトメトリーを用いて解析した。その結果、これらの膜タンパク質はいずれもトポロジー変化しなかった。従って、トポロジー変化はVAP特異的な現象であることが示唆された。
さらに、VAPの膜貫通ドメイン内やその付近の荷電性アミノ酸や親水性アミノ酸を疎水性アミノ酸であるロイシンに置換したVAP変異体を作製したところ、これらのVAP変異体ではトポロジー変化が抑制されていた。したがって、VAPの膜貫通ドメイン内やその付近の電荷アミノ酸や親水性アミノ酸がVAPのトポロジー変化に重要であることが示唆された。
トポロジー変化の分子メカニズムを解明するために、CRISPRスクリーニングに向けた条件検討を行った。「ALFA―VAP―V５を恒常的に発現させたＣａｓ９発現細胞にゲノム挿入型のｇＲＮＡライブラリーを添加し、ALFA/V５の細胞外シグナルが変化した細胞をＦＡＣＳで選別し、選別された細胞のゲノムに挿入されたgRNAのDNA配列をNGSで読む」という戦略でトポロジー制御遺伝子を探索する。現状としては、スクリーニングのための細胞株は樹立できており、次世代NGSを行うに至るまでのプロトコルは確立できた。確立したＣａｓ９発現細胞におけるｇＲＮＡ挿入効率及びゲノム編集効率が良好であることも確認できたため、ｇＲＮＡライブラリーを入手でき次第、スクリーニングを開始する。
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| 現在までの達成度 (段落) |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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