トランスファーRNA修飾酵素によるタンパク質品質管理機構の解明

• 研究課題/領域番号: 21K05272
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分37010:生体関連化学
• 研究機関: 産業医科大学
• 研究代表者: 坂口 怜子 産業医科大学, 医学部, 講師 (80723197)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2025-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: イオンチャネル / シグナル伝達 / 転移RNA / タンパク質品質管理 / 神経変性疾患 / 創薬

研究開始時の研究の概要

生物が恒常性を保つためには、タンパク質の翻訳とその品質管理が重要であり、tRNAの転写後修飾はその中核を担っている。特に37位グアノシンのメチル化は、原核生物では生存に必須である。このメチル化は生物間で保存されているが、修飾を担う酵素は原核生物と真核生物で異なっており、両者の違いを探索することは、タンパク質の収斂進化の知見として学術的に興味深いだけでなく、原核生物のみを標的とした副作用のない新規抗生物質設計の指針ともなり得る。
本研究では、各メチル転移酵素の金属要求性や、その上流の金属イオン濃度制御機構の探索と、真核生物と原核生物の酵素の違いを解明する。

研究実績の概要

細胞を構成する酵素・細胞骨格・抗体などを形作るタンパク質の合成機構は、全ての生物において共通であり、生命維持の根幹を成すシステムである。必要なときに必要なタンパク質を必要な量だけ発現させる仕組みにおいて、そのアミノ酸配列を正確に翻訳することは、タンパク質の品質管理上で一番重要である。そのため、遺伝暗号に従ってリボソーム上にアミノ酸を正しい順番で運ぶトランスファーRNA（tRNA）には、その正確さを担保するための仕組みが備わっている。tRNAが機能を発揮するためには、転写後に必要な修飾を受けた上で、各コドンに対応するアミノ酸でアミノアシル化されてリボソームに取り込まれる必要がある。修飾を担う酵素が選択性や反応速度などの点で正しく機能しなくなると、誤ったアミノ酸の取り込みや読み枠のズレなどによりタンパク質の品質が低下し、生体応答に異常をきたす。特に、メッセンジャーRNAとリボソーム上で塩基対を形成して特異的なアミノ酸認識に関わる、tRNAのアンチコドン領域（34～36位）とその周辺の配列の適切な修飾は、アミノ酸を正しい配列で結合させていく上で重要である。
tRNAの修飾のうちの一つである36位グアノシンのメチル化は、ワトソンークリック型の塩基対形成を阻害することで、タンパク質翻訳における読み枠のズレを防止する役割を担う。このメチル化を担う酵素は原核生物(TrmD)と真核生物(Trm5)で異なっており、原核生物のTrmDの欠損は致死性である。そして、原核生物の酵素のみ、その活性にCa2+、Mg2+、Mn2+などの2価金属イオン要求性がある。
そこで本研究では、この酵素活性に必須の金属イオンの細胞内濃度を制御している機構の解明を目指して、イオンチャネルの変異体の活性評価や、阻害剤の効果の検証を行なった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

本研究では、細胞内の金属イオンの濃度を制御する機構を明らかにすることを目的としている。具体的には、酵素の活性中心における金属イオン要求性や、その上流でイオン濃度を制御している分子実態の探索、その制御が機能しない場合の応答の変化と疾病との関連性の解明を目指している。本年度も前年度に引き続き、細胞内の金属イオン濃度を制御するイオンチャネルの分子実体として、外界の環境変化を感知してCa2+などを細胞内に流入させる非特異的陽イオン透過チャネルであるTransient Receptor Potential (TRP) チャネルファミリーの変異体の機能評価ならびに阻害剤の評価を行なった。
TRPファミリーは温度、 pH、レドックス環境、機械刺激など、それぞれが固有の刺激で活性化することが知られている。本年度は、腎障害患者から同定されてきたTRPCチャネル変異体の機能評価を行った。モデル生物として腎臓由来細胞を用いて、作製した変異体を遺伝子導入により発現させ、定常状態や受容体刺激時の細胞内Ca2+濃度の変化を測定した。評価した変異体のうち、数種類は細胞内へのCa2+流入量が減少し、数種類はCa2+流入能力が上昇していることを見出した。総合して、患者由来の遺伝子変異では、その臨床的な重篤さの度合いに応じて細胞内Ca2+流入能力が向上していることが明らかになった。そこで、チャネル機能の異常向上が疾患と関連することから、発症の抑制と進行を遅らせることを目指して、TRPCチャネルの阻害剤の評価を行った。
さらに、チャネル機能が異常に向上した変異を持つモデルマウスの作製に着手したが、本年度より別の競争的資金が採択され、本研究に対するエフォート率が下がったため、研究の進捗がやや遅れている。当初の計画では本年度中に変異マウスの評価まで行う予定であったが、来年度に行う見込みである。

今後の研究の推進方策

前年度までの成果で、HEK293細胞や膵細胞、腎細胞をモデル生物として用いて、膵炎や腎障害の患者から同定されたTRPチャネルの様々な変異体を遺伝子導入により発現させ、細胞内Ca2+濃度の変化を測定したところ、複数の変異体でCa2+流入能力が変化（向上、低下の双方）しており、患者由来の遺伝子変異では、その臨床的な重篤さの度合いに応じて細胞内Ca2+流入能力が向上していることが明らかになった。今後の方針として、各変異体の、Ca2+以外の金属イオン（Mg, Zn, Fe, Coなど）に対する透過性（選択性の変化）を評価したり、イオンチャネルに対する阻害剤の効果（作用機構への影響）を評価したりする。
また、TRPCチャネル機能の異常向上が疾患と関連することから、チャネル機能が異常に向上した変異を持つモデルマウスをCrispr-Cas9法で作製し、第１世代が生まれてきたところである。今後、この変異マウスたちの遺伝型を同定した後、組織を採取し、細胞骨格の形成やタンパク質産生における品質の変化があるか評価する。表現型の有意な差が観察された場合、TRPCチャネルの阻害剤をマウスたちに投与し、表現型の改善が見られるか評価を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Photoactive carbon monoxide-releasing coordination polymer particles (2022)
  • 著者名/発表者名: Carne-Sanchez Arnau、Ikemura Shuya、Sakaguchi Reiko、Craig Gavin A.、Furukawa Shuhei
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 58 号: 71 ページ: 9894-9897
  • DOI: 10.1039/d2cc03907a
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] A two-step screening to optimize the signal response of an auto-fluorescent protein-based biosensor (2022)
  • 著者名/発表者名: Tajima Shunsuke、Nakata Eiji、Sakaguchi Reiko、Saimura Masayuki、Mori Yasuo、Morii Takashi
  • 雑誌名: RSC Advances 巻: 12 号: 24 ページ: 15407-15419
  • DOI: 10.1039/d2ra02226e
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Critical contributions of pre-S1 shoulder and distal TRP box in DAG-activated TRPC6 channel by PIP2 regulation (2022)
  • 著者名/発表者名: Mori Masayuki X.、Okada Ryo、Sakaguchi Reiko、Hase Hideharu、Imai Yuko、Polat Onur K.、Itoh Satoru G.、Okumura Hisashi、Mori Yasuo、Okamura Yasushi、Inoue Ryuji
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 12 号: 1 ページ: 1-13
  • DOI: 10.1038/s41598-022-14766-x
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Cell-autonomous control of intracellular temperature by unsaturation of phospholipid acyl chains (2022)
  • 著者名/発表者名: Murakami A., Nagao K., Sakaguchi R., Kida K., Hara Y., Mori Y., Okabe K., Harada Y., Umeda M.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 38 号: 11 ページ: 110487-110487
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110487
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Osteoclasts adapt to physioxia perturbation through DNA demethylation (2021)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa Keizo、Seno Shigeto、Yoshihara Toshitada、Narazaki Ayako、Sugiura Yuki、Shimizu Reito、Kikuta Junichi、Sakaguchi Reiko、Suzuki Norio、Takeda Norihiko、Semba Hiroaki、Yamamoto Masamichi、et al
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 22 号: 12 ページ: 53035-53035
  • DOI: 10.15252/embr.202153035
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase B promotes Ca2+ mobilization and the inflammatory activity of dendritic cells (2021)
  • 著者名/発表者名: Marongiu Laura、Morii Takashi、Granucci Francesca, et al
  • 雑誌名: Science Signaling 巻: 14 号: 676
  • DOI: 10.1126/scisignal.aaz2120
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Functionally deficient TRPV6 variants contribute to hereditary and familial chronic pancreatitis (2021)
  • 著者名/発表者名: Hamada S, Masson E, Chen JM, Sakaguchi R, Rebours V, Buscail L, Matsumoto R, Tanaka Y, Kikuta K, Kataoka F, Sasaki A, Le Rhun M, Audin H, Lachaux A, Caumont B, Lorenzo D, Billiemaz K, Besnard R, Koch S, Lamireau T, De Koninck X; GREPAN Study Group, Genin E, Cooper DN, Mori Y, Masamune A, Ferec C
  • 雑誌名: Human Mutation 巻: 43 号: 2 ページ: 228-239
  • DOI: 10.1002/humu.24315
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Dynamic remodeling of TRPC5-caveolin-1-eNOS complexes regulates the precise signal transfer between Ca2+ and NO (2024)
  • 著者名/発表者名: Reiko Sakaguchi, Nobuaki Takahashi, Takashi Yoshida, Nozomi Ogawa, Yoshifumi Ueda, Satoshi Hamano, Kaori Yamaguchi, Seishiro Sawamura, Shinichiro Yamamoto, Yuji Hara, Tomoya Kawamoto, Akito Nakao, Masayuki X. Mori, Tetsushi Furukawa, Shunichi Shimizu, Ryuji Inoue, and Yasuo Mori
  • 学会等名: 第101回 日本生理学会大会
• [学会発表] Effect of novel selective TRPC3/6 dual inhibitor L862 to rat PAN-induced nephropathy (2023)
  • 著者名/発表者名: Reiko Sakaguchi, Yoshimune Matsuda, Ryo Okada, Marie Konomi, Takanori Kihara, Takeshi Yamamoto, Yoshitaka Isaka, Ryu Nagata, Masayuki X. Mori
  • 学会等名: 第97回日本薬理学会年会
• [学会発表] イオンチャネル機能と連動する蛋白尿におけるバイオマーカーの探索 (2023)
  • 著者名/発表者名: 松田 由宗、坂口 怜子、岡田 亮、木原 隆典、永田 龍、森 誠之
  • 学会等名: 第96回日本生化学会大会
• [学会発表] 蛋白尿改善を目指したイオンチャネル阻害剤の 開発と評価 (2023)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子, 松田 由宗, 岡田 亮, 石兼 真, 高橋 富美, 片渕 瑛介, 中山 敏幸, 眞田 賢哉, 上田 陽一, 木原 隆典, 永田 龍, 森 誠之
  • 学会等名: 令和５年度 産業医科大学学会
• [学会発表] PAN腎症モデルラットに対するTRPC3/6チャネル阻害剤L862による蛋白尿改善 (2023)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子、松田 由宗、岡田 亮、木稲 真利慧、永田 龍、森 誠之
  • 学会等名: 第100回 日本生理学会大会
• [学会発表] TRPC5-Caveolin-1-eNOSシグナルタンパク質複合体が内皮細胞におけるCa2+とNOシグナル調節に果たす役割 (2023)
  • 著者名/発表者名: 坂口怜子，森誠之, 森泰生
  • 学会等名: 第52回日本心脈管作動物質学会
• [学会発表] 新規選択的TRPC3/6チャネルブロッカーによるラットPAN-誘導性腎症の緩和 (2022)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子、岡田 亮、松田 由宗、木稲 真利慧、永田 龍、森 誠之
  • 学会等名: 第99回 日本生理学会大会
• [学会発表] Visualization and Understanding of Subcellular Thermodynamics using Fluorescent Protein-based Thermosensors (2021)
  • 著者名/発表者名: 坂口 怜子
  • 学会等名: 第59回 生物物理学会年会
  • 招待講演
• [産業財産権] 腎臓疾患の予防および／または治療用医薬組成物 (2023)
  • 発明者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 権利者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 産業財産権種類: 特許
  • 出願年月日: 2023
  • 外国
• [産業財産権] 腎臓疾患の予防および／または治療用医薬組成物 (2022)
  • 発明者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 権利者名: 永田龍,猪阪善隆,山本毅士,余西洋明,森誠之,坂口怜子,岡田亮
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2022-029773
  • 出願年月日: 2022