| 研究課題/領域番号 |
21K05278
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37010:生体関連化学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
稲垣 賢二 岡山大学, 環境生命自然科学学域, 特任教授 (80184711)
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| 研究分担者 |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (40346143)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | L-リジン酸化酵素 / L-グルタミン酸酸化酵素 / 基質認識機構 / 酵素の成熟化 / X線結晶構造解析 / L-リシン酸化酵素 / 成熟化機構 / 飽和変異 / L-glutamate oxidase / L-lysine oxidase / processing / substrate specificity / biosensor |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では， 高基質特異性のL-アミノ酸酸化酵素に焦点を当て， 遺伝子工学, 進化工学等の生物工学的手法を駆使して， そのユニークな成熟化機構と基質認識機構を明らかにすることを目的とする。数多くの存在が知られているL-アミノ酸酸化酵素の中で際立って厳格な基質特異性を示す放線菌由来のL-グルタミン酸酸化酵素と糸状菌由来のL-リシン酸化酵素という極めてユニークな性質を持つ微生物酵素に焦点を当て， 厳格な基質特異性を示す要因とプロッセシングによる活性化， 安定化の機構を解明する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では，高基質特異性L-アミノ酸酸化酵素である放線菌由来のL-グルタミン酸酸化酵素(LGOX)および糸状菌由来のL-リシン酸化酵素（LysOX）の基質認識機構とプロセシングによる活性化・安定化機構を明らかにし，特定アミノ酸のみを基質とする酵素や，逆に全てのアミノ酸に作用する酵素といった新規酵素群の創出を目的としている．2022年度までにLysOXの基質認識機構と活性化・安定化機構，LGOXの基質認識機構を解明した．2023年度は，LGOXのプロセシングによる活性化・安定化機構を解明するため，LGOX前駆体のX線結晶構造解析に取り組み，2.76A分解能で解析に成功した． 当初MBP融合蛋白質として大腸菌で発現・精製したところ，4量体と2量体が得られ，それぞれ結晶化した．しかし，分解能が4A程度の結晶しか得られなかった．そこで，タグの変更等を行い精製法の改良を行なったところ，N末にHis-tagを付加して発現し，さらにリシン残基のメチル化して精製した試料について4量体のみが得られ，これを結晶化したところ3A分解能を超える結晶が得られた．得られた結晶はtwinであったがソフト的に分離することで，最終的に2.76A分解能の構造が得られた．この構造をプロセシング後の構造と比較したところ，プロセシングにより２本のヘリックスが移動することで基質主鎖カルボキシ基と直接相互作用するY562と基質側鎖と相互作用するW564の位置が基質との相互作用に適した位置に移動していた．すなわち，LGOXは基質の入口を物理的に塞ぐのではなく，基質結合部位の構造を小さく変化させることで成熟化後の活性を増大させていることがわかった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
長年未解明であったLGOX前駆体の構造解析に成功し，既知の成熟型酵素との構造比較を行うことができた．その結果，LGOXの成熟化機構の一端を明らかにした．
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでに得られている活性部位付近の残基の置換によりTyrに対する基質特異性を獲得したLGOX E617変異体の構造解析および構造に基づく活性部位付近の残基に複数の変異を導入することでさらに基質特異性の異なる酵素の作成を実施する．
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