| 研究課題/領域番号 |
21K05285
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分37020:生物分子化学関連
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
葛西 宏介 弘前大学, 保健学研究科, 准教授 (50400148)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,120千円 (直接経費: 2,400千円、間接経費: 720千円)
2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 抗菌タンパク質 / 金属配位 / 活性調節 / 抗菌 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
Ｌ-アミノ酸オキシダーゼ（LAAO）は、L-アミノ酸を基質にラジカルを産生して、病原性細菌の菌膜酸化と菌体破壊を引き起こす。その一方で、正常細胞には細胞毒性を示さないことが報告されている。近年、金属を介したLAAO複合体形成と基質結合ドメイン干渉（L-アミノ酸を利用することができない）が予測されており、金属がLAAO活性を調節することが強く推察されている。そこで本研究は、LAAO複合体形成と活性化調節ならびに構造の安定性に金属がどのように関与するのかを詳細に検証し、「生体内分子のLAAOはなぜ細菌特異的な活性を示すのか？」を解明することが目的である。
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| 研究実績の概要 |
研究項目① 各種LAAOの人工合成（2021～2023年度）：psLAAOの金属配位アミノ酸部位を金属が配位することができないアラニンに置換した各種変異型を作製している。タンパク質表面にある348番ヒスチジンならびに209番ヒスチジン（陰性コントロール）をアラニンに置換したものは合成収量が解析可能な十分量を確保できているが、241番スレオニンならびに406番アスパラギン酸に関しては、収量が少なくタンパク質発現条件の最適化を図っている。また、当初の酵母株から高収量発現株（プロテアーゼ欠損株）に変更して発現誘導を実施している。
研究項目② LAAO複合体形成の確認（2021～2022年度）：複合体形成実験で使用するFLAG配列を付加したpsLAAOは、合成収量が少なくFLAG検出感度も不十分であるため発現合成条件の最適化をおこなっている。psLAAOをタンパク質架橋剤（BS3：側鎖にアミノ基をもつリシン同士を架橋）で処理することで複合体を検出することが可能となっており、現状ホモ4～8量体を形成することが推察されている。複合体数を特定するべくカラム分離・分取を実施している。
研究項目③ 安定性試験（2022～2023年度）：安定性試験に関して、キレート剤を用いて金属除去することにより活性の不安定化が認められている。348番ヒスチジンをアラニンに置換させたpsLAAOは、キレートを用いて金属を除去したものと同様に不安定性が認められている。209番ヒスチジンをアラニンに置換させたものは変異を挿入しても安定であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
各種人工タンパク質を発現させるプラスミドベクターの購入が困難（製造元販売停止：サーモサイエンティフィック社）となりの構築に時間が掛かっており、当初の実施計画から遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究進捗に遅れが生じている項目について回復に努めている。また、発現量が低い変異型タンパク質は、高収量株に変更して合成を実施している。2023年度は、研究項目④金属捕捉分子機構解析（2022～2023年度）を実施する。psLAAOを添加した細菌培養上清からpsLAAOをアフィニティーカラムで精製・回収し、微量金属を検出する。
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