| 研究課題/領域番号 |
21K05356
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38020:応用微生物学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
佐藤 勝也 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 量子バイオ基盤研究部, 上席研究員 (90370402)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | PprIタンパク質活性化 / 細胞内Mn濃度 / DNA損傷応答機構 / DNA修復機構 / PprIタンパク質 / Mn輸送 / 放射線抵抗性細菌 / デイノコッカス・ラジオデュランス / DdrOタンパク質 / Mn / 環状ヌクレオチド |
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| 研究開始時の研究の概要 |
放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランスの効率的なＤＮＡ修復を担うDNA損傷応答機構において、ＤＮＡ修復タンパク質の発現誘導などの分子機構は十分に解明されていない。そこで本研究は、DNA損傷応答機構におけるスイッチタンパク質であるPprIの活性化に着目し、ＤＮＡ損傷の認知やシグナル伝達経路について解析を行うことで、ラジオデュランスのＤＮＡ損傷依存的なＤＮＡ修復タンパク質の発現誘導の分子機構を明らかにする。これらの研究を通して、生命維持の根幹機能であるＤＮＡ修復機構を解明し、有用遺伝子資源としての利用や生命科学分野の新たな研究開発の展開に貢献することを目指す。
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| 研究実績の概要 |
デイノコッカス・ラジオデュランスのpprI遺伝子は、構成的な発現をしていることから、DNA損傷時にPprIタンパク質を活性化する機構の存在が予想される。これまでに、PprIタンパク質の機能相補試験から、DNA修復遺伝子群の脱抑制にはメタロプロテアーゼ活性が最も重要であること、また、Mnを高蓄積により放射線耐性が向上することを明らかにした。そこで、細胞内Mn濃度とPprIタンパク質の活性化との関連性について解析した。具体的には、DNA損傷応答性のddrA遺伝子のプロモーター配下にルシフェラーゼ遺伝子を連結したカセットを野生株及びpprI欠損変異株に導入し、レポーター株WTP及びXDAP株を作製した。さらに、XDAP株に野生型及び変異型pprI遺伝子発現プラスミドを導入し、レポーター株DAW及びDAM株を作製した。レポーター株は、ガンマ線(2kGy)を照射後、TGYあるいはTGY/Mn培地で30℃・2時間培養し、レポーターアッセイを行った。その結果、DAW株は、ガンマ線照射後に細胞内Mn濃度が上昇する傾向がみられ、PprIタンパク質の活性化は細胞内Mn濃度に依存していると考えられた。メタロプロテアーゼドメインに変異を持つ変異株DAM119及びDAM149は、ルシフェラーゼ活性の誘導がみられず、PprIタンパク質がMnと配位結合できないと活性化されないことが分かった。DNA結合ドメインに変異を持つ変異株DAM196は、Mn添加によって、野生型と同様の活性誘導がみられ、DNA結合ドメインの機能欠損が相補された。一方、環状ヌクレオチド結合ドメインに変異を持つ変異株DAM260は、Mn添加でも、野生型よりも低い活性であった。これらの結果から、メタロプロテアーゼ活性中心でのMnの配位結合がPprIタンパク質の活性化に直接的な働きを担っていると同時に、環状ヌクレオチド結合ドメインもMnによるPprIタンパク質の活性化に関与していることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画通り、PprIタンパク質の活性化に細胞内Mn濃度が影響していることを明らかにすることができたが、環状ヌクレオチドの影響を評価することができず、やや遅れを生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
作製したPprI欠損変異株を用いて、DNA損傷後の細動内環状ヌクレオチド量の変動、及びルシフェラーゼ遺伝子発現を指標としたレポーターアッセイを実施することで、PprIタンパク質の活性化に与える影響について解析することで、デイノコッカス・ラジオデュランスのPprIタンパク質依存的DNA損傷応答機構の全容解明に向けた研究を推進する。
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