β酸化経路の再考に基づくω-3高度不飽和脂肪酸の代謝変換の研究

研究課題

研究課題/領域番号	21K05364
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分38020:応用微生物学関連
研究機関	京都大学
研究代表者	小川拓哉京都大学, 化学研究所, 助教 (40756318)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円) 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円) 2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円) 2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
キーワード	ω-3高度不飽和脂肪酸 / エイコサペンタエン酸 / ドコサヘキサエン酸 / 微生物変換 / β-酸化酵素 / タンパク質間相互作用 / β-酸化 / 転写調節 / 高度不飽和脂肪酸 / 生物変換 / 海洋性細菌 / β酸化酵素 / リン脂質アシル基転移酵素
研究開始時の研究の概要	EPA生産菌S. livingstonensis Ac10に見出された新奇のDHA-EPA変換能について、関連する代謝酵素がどのように協同して本変換を達成するのか、また、これらの酵素遺伝子がどのようにDHAの存在に応答して発現するのか、といった分子メカニズムを遺伝子の変異解析や生化学的な解析を通して明らかにする。また、得られた知見を活用して、本菌のEPA/DHA代謝を改変して遊離EPA生産系の開発を試みる。
研究実績の概要	一般的に細菌は高度不飽和脂肪酸 (PUFA) をつくらないが、一部の海洋性細菌はエイコサペンタエン酸 (EPA) やドコサヘキサエン酸 (DHA) といったω-3 PUFAをつくる。これらの細菌におけるPUFA生合成の理解は進んでいるが、分解や変換といった他の代謝経路については未解明な点が多い。細菌におけるPUFA代謝の理解拡充のため、本研究ではEPA生産性細菌Shewanella livingstonensis Ac10に見出したDHA-EPA変換機構の解明に取り組んだ。我々はこれまでに、脂肪酸のβ酸化を担う2種の酵素がDHA-EPA変換に関わることを明らかにしている。そこで本年度は、他のβ酸化酵素ホモログである、二機能性の2-エノイルCoAヒドラターゼ/3-ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ (FadBとFadJ)、および3-ケトアシルCoAチオラーゼ (FadAとFadI) が本変換に関わるか検討した。各遺伝子の単独欠損株、およびFadB/FadJの二重欠損株とFadA/FadIの二重欠損株を作製し、DHA-EPA変換能への影響を調べたところ、二重欠損株でのみ本変換能が損なわれることが分かった。このことから、2つずつ存在するFad酵素ホモログの両方が本変換を担うことが強く示唆され、本変換が完全なβ酸化経路によって触媒されることがわかった。本成果について、1件の学会発表を行った。また、β酸化を経由しつつもDHAを完全分解せずにEPAを生じる分子機序として、Fad酵素と、EPAを膜リン脂質に導入するアシル基転移酵素PlsC1との相互作用を考え、共免疫沈降法によりこれを検証した。エピトープタグを利用した相互作用分子の検出系を確立したところであり、現在、これを利用して共免疫沈降実験に取り組んでいる。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由当初想定していたFadBとFadAに加え、それらのホモログ酵素であるFadJとFadIもDHA-EPA変換に関わることが明らかになった。これにより、S. livingstonensis Ac10において本変換を担う責任酵素をすべて同定することができ、どのような反応を経てDHAがEPAへと変換されるかがわかった。また、予備検討の結果、Fad酵素とPlsC1との間の相互作用が認められ、本変換で生じるEPAがどのようにして細胞内に蓄積するかについて知見が得られつつある。
今後の研究の推進方策	Fad酵素とPlsC1との間の相互作用を実証するため、共免疫沈降実験を進める。これらの分子間の相互作用は弱いことが想定されるため、実験条件の最適化や架橋剤の併用を検討する。また、これらの酵素の組換え発現・精製方法をすでに確立しているため、これを利用して組換えタンパク質のプルダウン実験や等温滴定熱量計を用いた相互作用の検出・定量も検討している。