研究課題
基盤研究(C)
本研究では，セロビオース2-エピメラーゼ (CE) を用いた反応特異性の分子基盤の解明とマンノース2-エピメラーゼ (ME) の高活性変異酵素の開発を行う．CEに関しては，各種変異酵素の機能・構造解析，基質アナログへの反応解析を通じ反応特異性を支配する構造因子を解明する．MEに関する研究では，大腸菌外膜での組換え酵素生産系とマンノース資化能を失った変異株を用いた効率的高活性変異酵素スクリーニング技術を構築し，高活性変異酵素を開発する．
糖質の高度利用には，希少糖質の効率合成法の開発が欠かせない.本研究ではセロビオース2-エピメラーゼ (CE酵素) やマンノースイソメラーゼなど様々な糖質異性化酵素を含む酵素群の反応特異性を制御する機構の解明と高活性変異酵素の開発を目的とした. CE酵素の基質結合部位の反応特異性への寄与の評価のため，還元末端糖残基の2OH基と水素結合可能なアミノ酸残基に部位特異的飽和変異を導入した．親酵素としてRhodothermus marinus由来耐熱性CE酵素を用いた．各変異酵素のエピメラーゼ反応速度とイソメラーゼ反応速度をそれぞれGlcβ-4ManとGlcβ-4Fruに対する初速度に基づき評価した．各変異酵素はいずれも野生型酵素よりも著しく低いエピメラーゼ反応速度を示したが，Asn196変異酵素は，AlaをはじめとするAsnと同程度かより小さな側鎖を持ついくつかのアミノ酸への置換によりイソメラーゼ反応速度は大きく低下せず，野生型酵素より著しく高いイソメラーゼ反応への特異性を示した．His200変異酵素ではLys置換体のみが活性型酵素として取得され，本変異酵素も高いイソメラーゼ反応への特異性を示した．Tyr124に関しては活性型の変異酵素が得られなかった．高活性ME酵素を取得することを目的として昨年度までに構築した高活性型変異酵素のスクリーニング系により変異酵素をスクリーニングしたが，野生型酵素を大きく超える比活性を持つ変異酵素の取得には至らなかった．ME酵素の結晶化条件の探索を進め，高分解能での結晶構造の決定に至った．基質フリー構造に加えて基質アナログのグルシトールとの複合体構造も決定した．これらの構造解析の結果，単糖特異性に重要と予測されていたループ構造が基質との結合に際して大きく動くことが明らかになり，誘導適合により単糖基質を捕捉する機構が明らかになった．
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すべて 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件) 学会発表 (5件) (うち国際学会 2件、 招待講演 2件) 備考 (2件)
Acta Crystallographica Section D: Structural Biology
巻: 79 号: 7 ページ: 585-595
10.1107/s205979832300390x
http://lab.agr.hokudai.ac.jp/biochem/
