| 研究課題/領域番号 |
21K05397
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分38030:応用生物化学関連
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| 研究機関 | 武蔵野大学 |
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研究代表者 |
武藤 裕 武蔵野大学, 薬学部, 教授 (30192769)
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| 研究分担者 |
桑迫 香奈子 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (10568736)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | スプライシング制御因子 / スプライシング病 / 協働性 / 構造生物学 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
近年，mRNA前駆体のスプライシング反応の不全で発症する“スプライシング病”の存在が明らかになってきた。これらの多くは，スプライシング反応初期におけるイントロン部位確定の不具合が原因であり,主にスプライシング制御因子が正しく働かないために発症する。脊髄性筋萎縮症についても，SRSF1，Tra2bなどの制御因子の選択的スプライシングの制御不全が原因である。本研究では，これらの制御因子に注目し,NMR法やX線結晶解析を主に用いてその動的な高次構造情報から制御メカニズムを明らかにし,隠されたスプライシングコードの解明を目的とする。
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| 研究実績の概要 |
申請者は、スプライシング制御因子による生体制御の破綻から生じるスプライシング病について構造生物学的な理解を目的としている。本研究では、脊髄性筋萎縮症の発症ではSF2などの制御因子が関わる運動神経細胞生存遺伝子(Survival motor neuron: SMN)の選択的スプライシングの制御不全が起きている。SF2 RRM1と標的配列を含むRNA断片の複合体を結晶化し、これをＸ線結晶構造解析することで、SF2タンパク質の標的配列認識機構を明らかにすることを目標とした。また、他のスプライシング因子に含まれる同様の機能ドメインについての構造解析を試み、この機能ドメインによるクロストークに関する知見を得ようと考えた。昨年度までSF2 RRM1と標的配列を含むRNA断片との結晶化を行って微結晶が得られたが、再現性がなかった。本年度は、結晶化の再現性をあげるために、(1)SF2についてアミノ酸配列の保存性とRRM1単体の構造から、RNA結合能を保持しつつ、構造的に柔軟な部分を最小限に抑えたコンストラクトを作成し結晶化を試みた。(2)また、RNA分子間で塩基対を形成させて結晶パッキングを促進させる目的で、ターゲットとなるRNA分子についてRNA分子間で塩基対を形成させて結晶パッキングを促進させるよう細工をしたRNA断片2種類を用いて、RRM1との共結晶化の条件を検討した。その結果、2種類のRNA共に1つの条件下から結晶を得た。現在、さらに結晶化の条件の最適化を進めている。また、真核生物でスプライシング反応において働くRNA結合ドメインとしてはRRMドメインのほかにKHドメインがある。RNAの二次構造部分の変化によるRNA認識を考察するため、結合に一本鎖部分だけではなく、二次構造をとる部分も必要とするRbfAのKHドメインについて構造決定を行い、下記にしめすように投稿論文として発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は、大学としは、一昨年より研究環境規制は緩和された。しかし、実際にはCOVID19の急拡大時期に、研究室にもおおきな影響が表れてしまった。現在は、ワクチンの接種が３回以上になっており、通常の運営状態にもどってきている。今後、遅れを取り戻すように計画を進めていきたいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
SF2 RRM1を用いたRNAとの複合体解析では、タンパク試料の安定性、およびRNAとの複合体の結晶化について検討を加えていく必要があった。本年度は、この蛋白質のコンストラクトの変更などによって安定的な供給条件の検討を進めており、この検討を継続する。また、安定的な蛋白質試料の調製法として無細胞蛋白質合成系によるタンパク試料の調製を試みており、さらに構造解析に最適な蛋白質試料の調製について検討をすすめる。また、これらの因子は,RRMドメインというRNA結合ドメインを共通にもつが、スプライシング反応が進行する上で、他の機能ドメインも機能発現に必要な場合がある。そのため、このような因子についてもクロストークを起こす可能性がある因子についても、構造的な情報を得て、これらの因子の協働性について考察していく。
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