PCRによる1分子DNA検出性能の評価

• 研究課題/領域番号: 21K05494
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分38050:食品科学関連
• 研究機関: 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
• 研究代表者: 高畠 令王奈 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20463466)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 完了 (2023年度)
• 配分額: 4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円); 2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円); 2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円); 2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
• キーワード: 定量分析 / DNA / 低濃度 / 極低濃度 / PCR / 標準物質 / 1分子

研究開始時の研究の概要

PCRの確認配列が直列に多コピーつながった標準細胞を作出する。標準細胞を作出後、PCR用プレートに１細胞ずつ分注する。さらに、複数のリアルタイムPCR装置で精度評価を行う。本研究の遂行上、１コピー検出性能の評価が可能な標準物質が不可欠であることから、（株）リコーの協力を得て標準プレートを作出する。

研究実績の概要

本研究では、DNA1分子の検出の可否を評価することを目的としている。一般的には、PCRは、１分子のDNAを検出可能であると考えられており、それを前提に議論されることが多いが、実際には検証はされていない。1コピーの検出性能を正確に評価するには、確実に標的配列を１コピー含む標準物質の存在が不可欠である。本研究では、当初、このような標準物質として細胞を用いる手法を検討していたが、標準細胞をインクジェットで分注する技術の利用が困難になってしまったため、限界希釈法を導入した。1コピーの標的配列と、それとは別の確認配列を同じDNA分子内に複数コピー導入し、標準DNAとする。このような標準DNAの溶液を限界まで希釈し、確認配列によってDNAの存在を確認する。さらに、標的配列によって、DNA1分子の検出の可否を検討する。これにより、細胞法と同等の検証が可能である。今年度は、昨年度に続き、このような標準DNAのコンストラクションを試みた。昨年度までに、確認配列を8コピー導入した標準DNAを作出したが、今年度は、さらに16コピー導入したプラスミドの作出を試みた。これは、限界希釈を行ったプラスミドにおいても、万が一2コピー入ってしまった場合が想定されるため、１コピーとの違いを確認するための試みである。文献より、リアルタイムPCRでは、4コピー以上のDNAであれば検出可能である旨の報告があるが、定量は、通常20コピー程度は必要であると考えられる。