| 研究課題/領域番号 |
21K05530
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分39010:遺伝育種科学関連
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
種坂 英次 近畿大学, 農学部, 教授 (80188391)
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| 研究分担者 |
築山 拓司 近畿大学, 農学部, 准教授 (00423004)
白澤 健太 公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 室長 (60527026)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 2,340千円 (直接経費: 1,800千円、間接経費: 540千円)
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| キーワード | 担子菌 / エノキタケ / 子実体形成 / 遺伝子発現 / 機能解析 / 子実体形成関連遺伝子 / 過剰発現 / 遺伝子ターゲティング / 育種モデル菌 / 子実体形成不全株 / 低温刺激 / 発現解析 / 比較ゲノミクス / トランスクリトーム解析 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本課題では、エノキタケの子実体形成不全を示す変異株を供試材料として、①子実体形成不全を引き起こす変異核の同定、②子実体形成不全株と野生株の比較ゲノム解析、③フラスコ内での子実体形成発現系を用いたRNA-seq解析による、子実体形成関連候補遺伝子の同定、④食用担子菌における栄養成長から生殖成長へのマスタースイッチを含む転換機構の全容解明を目的とする。
本研究の成果は、担子菌類の生殖成長への転換機構を解明するのみならず、栽培菌における発茸処理のタイミングを含む栽培管理、変異発生の少ない安定した栽培品種の育成についての基礎的知見を与え、食用菌においてもゲノム編集による育種の道を拓く。
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| 研究実績の概要 |
菌床栽培における低温刺激による子実体形成に対して、変異株では低温下でも子実体を形成しないという現象をフラスコ内の液体培地上で再現した。また、この培養系を用いて、RT-qPCR解析に加えてRNA-seq解析からhyd1やFDSなど数種の子実体形成関連候補遺伝子を特定してきた。さらに、過剰発現およびノックアウトの両面からの遺伝子機能解析系を確立しつつある。子実体形成不全変異株(d3)のプロトプラスト-PEG法によるFDS過剰発現カセットの導入によって、菌床培地での子実体形成能が回復することを観察している。一方、遺伝子ターゲティングによるノックアウト株の作成にあたって、真菌類のDNA修復は非相同末端結合が主な経路であり、相同組換えによる遺伝子ターゲティングの効率は極めて低いと考えられる。そこで、ウシグソヒトヨタケのゲノムデータベースを参照し、非相同末端結合に関わる３つの遺伝子（ku70, ku80, およびLingIV）と相同な配列がエノキタケゲノムにおいても存在することを確認し、このうちLigIVを破壊した非相同末端結合破壊系統の作出を試みてきた。その結果、相同組換えによる置換を期待して得られた形質転換体904系統のうち、1系統のみにおいてゲノムDNAの置換およびRT-PCRによるLigIV発現の無効化を確認した。この結果はアカパンカビのような真菌類と同様にエノキタケにおいても非相同末端結合がDNA修復における主要な経路であることを示している。得られた破壊系統を用いることによって相同組換えによる遺伝子ターゲティング（ノックアウト系統の作成）効率の飛躍的な向上が期待される。フラスコ中の液体培地から菌糸体を分取し核酸抽出を容易にする培養系、および過剰発現とノックアウトの遺伝子機能解析系を確立した現在、育種モデル食用菌エノキタケを用いた生殖相転換機構の全容解明は既に実証段階にある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ここまでの研究で、子実体形成株（野生株）および子実体形成不全株の発現解析比較から数種の子実体形成関連遺伝子が同定された。しかしながら、これら遺伝子の発現が同調することから、発現を制御するマスタースイッチの存在が推定され、さらに網羅的な解析が必要となった。そこで、子実体形成株群と形成不全株群のRAD-seq解析を計画した。ここで、両株群の遺伝的背景をできるだけ均一にするために、子実体形成不全株からの稀な子実体と担子胞子の採取を試みている段階にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
子実体形成株群と形成不全株群を作成し、RAD-seq解析により、子実体形成関連遺伝子群を特定する。さらに、候補遺伝子のノックアウトおよび過剰発現により、機能解析を実施し、子実体形成関連遺伝子の発現を制御するマスタースイッチを見出す。
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