| 研究課題/領域番号 |
21K05770
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
木谷 洋一郎 金沢大学, 環日本海域環境研究センター, 准教授 (70565340)
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| 研究分担者 |
亀井 宏泰 金沢大学, 生命理工学系, 准教授 (00610362)
長島 裕二 新潟食料農業大学, 食料産業学科, 教授 (40180484)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
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| キーワード | L-アミノ酸オキシダーゼ / 生体防御 / ウイルス感染 / ゼブラフィッシュDanio rerio / 魚類自然免疫 / 抗菌タンパク質 / 魚類 / 過酸化水素 / ROSシグナル / ゼブラフィッシュ / 生体防御物質 / 自然免疫 / ROSシグナリング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では魚類LAOの新しい機能について言及するため、次の3点について検討する。はじめに、微弱なLAO活性を検出するために高感度LAO活性測定法を開発する。次にLAOが生じた過酸化水素の標的となりうる分子について量的変化をとらえる。最後にLAO-KO魚を作出し、これを用いて健康および細菌感染した状態におけるLAO活性、過酸化水素標的分子の変化そして免疫系の状態について野生型魚と比較する。これらの結果を俯瞰することでLAOを起点としたROSシグナリングが魚類の免疫系に与える影響を評価する。
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| 研究実績の概要 |
L-アミノ酸オキシダーゼ（LAO）はアミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒し，その結果として生じた過酸化水素が抗菌活性を示す。LAOは一部の魚類において生体防御物質として機能するが，LAO活性を示さない魚種も多い。本申請課題ではLAO遺伝子を持ちつつもLAO活性を示さない魚種としてゼブラフィッシュを用い，局所においてLAO由来の過酸化水素が活性酸素種（ROS）シグナリングの起点となりうるか解明を試みた。はじめに，微量な過酸化水素を測定するために高感度過酸化水素測定法を開発した。これはLAO由来過酸化水素をフェントン反応によりヒドロキシラジカルとし，これがクマリンを攻撃し生じたヒドロキシクマリンを蛍光HPLCで定量することを原理とする。本法は従来のペルオキシダーゼ‐オルトフェニレンジアミン呈色反応に基づくLAO活性測定と比較して100倍程度高感度であった。これをもってゼブラフィッシュ全身抽出物のLAO活性を測定したが基質アミノ酸に依存した過酸化水素産生は認められなかった。次に，ゼブラフィッシュLAO特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングによりゼブラフィッシュ各組織のLAO分布を調べたが，LAO特異的なバンドは確認できなかった。また，ゼブラフィッシュLAO遺伝子特異的プライマーを用いた定量PCRの結果，ゼブラフィッシュは健康な状態ではLAO遺伝子の発現がごくわずかであることがわかった。最後に，ゼブラフィッシュに各種免疫誘導物質を腹腔内投与してLAO遺伝子の発現量を調べたところ，ウイルス由来二本鎖RNAを模したPoly（I：C）投与によりコントロール群と比較して肝臓で113倍，消化管70倍，鰓で26倍と増加することがわかった。以上の結果から，ゼブラフィッシュにおいてLAOは通常発現が抑制されており，ウイルス感染時に発現が誘導されることが明らかとなった。
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