| 研究課題/領域番号 |
21K05787
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分40040:水圏生命科学関連
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
泉 庄太郎 東海大学, 海洋学部, 教授 (90450379)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 冷水病原因菌 / CRISPR / プラスミド / ファージ / 冷水病 / CRISPRアレイ / 起源解明 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
我が国のアユに大きな被害を与える冷水病は1980年代後半に初確認された。このアユの冷水病は北米のサケ科魚類由来の外来疾病であることが強く疑われているが，アユとサケ科魚類の冷水病原因菌は，表現型も遺伝子型も大きく異なることから，アユ冷水病の起源は依然として不明である。
本研究では，ゲノム編集技術として大きな注目を集めているCRISPR-Casシステムが細菌における免疫システムであるという本来の機能に注目し，冷水病原因菌のCRISPRアレイ中に残される細菌が受けた外来核酸の侵入の歴史を読み解くことにより，アユ冷水病の起源を過去にさかのぼって解明しようとする試みである。
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| 研究実績の概要 |
F. psychrophilumのCRISPRアレイに関しては，新たにCRISPRアレイ領域のプライマーペアを設計し，約200株のF. psychrophilumのDNAをテンプレートにPCRを行った。得られたPCR産物の塩基配列を決定してCRISPRアレイが確認された配列からスペーサー配列を抽出して，既知のF. psychrophilumファージの塩基配列と比較した。その結果，69株でCRISPRアレイの塩基配列を決定し，リピート配列長は46 bpで全て塩基配列は同一であり，スペーサー配列数は4から21であること，スペーサー配列の多くがファージ由来であることがわかった。さらに，スペーサー配列の並び順について菌株間での比較も行ったところ，3’端側ではで共通性が見られたのに対し，5’端側に行くにつれて変化する傾向が見られた。これは各菌株のファージ感染履歴の違いを反映していることが示唆された。
F. psychrophilumのファージに関しては，これまでの分離株数が少ないことから，単離方法について検討した。サンプルには昨年度冷凍保存した河川水と，新たに群馬県の河川水を用い，河川水中に含まれるファージをランダム培養，DNA抽出し，ファージDNAの存在を確認できた。現在，ファージ単離方法について再検討中である。プラスミドに関しては，F. psychrophilum NCIMB1947，FPC814，FPC840およびOKM9802の4株のプラスミドの全塩基配列を次世代シーケンスで決定した。塩基数はそれぞれ2602 bp，3407 bp，4106 bpおよび 5109 bpで，FPC814の3407 bp以外は今回新たに明らかとなった塩基配列であった。また，全てのプラスミドに複製開始タンパク質が存在したが，OKM9802のみにはTransposaseが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
F. psychrophilumのCRISPRアレイに関しては，当初想定したスペーサー配列の並びの変異が実際の分離菌株間で確認されたことから，極めて順調に進捗していると判断した。
F. psychrophilumのファージに関しては，冷凍保存した河川水サンプルからのランダム培養ができることがわかり，これらの冷凍サンプルおよび新規サンプルからファージ培養とそのDNAの抽出によって河川水中のF. psychrophilumファージの存在が複数の河川で確認できたものの，これらのファージの単離方法については再検討が必要であり，やや進捗が遅れ気味である。F. psychrophilumのプラスミドに関しては，当初予定していた４種類のサイズのプラスミドの塩基配列を全て明らかにすることができたことから，順調に進捗していると考えられる。
全体としては一部遅れ気味の小課題もあることから，控えめではあるが「やや遅れている」との自己評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
F. psychrophilumのCRISPRアレイに関しては，必要であれば新たなプライマーの開発も視野にいれつつ引き続き同様の方法により多くのF. psychrophilum株でCRISPRアレイの塩基配列を調べて，宿主魚種間や分離地域間，分離年代の違いによるスペーサー配列の並びの傾向を調べていく。
F. psychrophilumのファージに関しては，単離方法についての再検討を行う。河川水サンプルは冷凍によって保存できることがわかったので，単離方法の再検討を行いながら，より多くの河川水のサンプルの収集を行う。F. psychrophilumのプラスミドに関しては，当初予定していた４種類のサイズのプラスミドの塩基配列を全て明らかにすることができたので，さらに発展してその機能についても検討することを計画している。
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