| 研究課題/領域番号 |
21K05912
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42010:動物生産科学関連
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
ソムファイ タマス 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (90547720)
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| 研究分担者 |
原口 清輝 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (10324576)
菊地 和弘 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長補佐 (20360456)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
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| キーワード | ブタ接合体 / ガラス化保存 / ゲノム編集 / OCT4 / CD46 / ブタ卵子 / DNA二本鎖切断 / DNA修復機能 / 胚盤胞発生 / ブタ / 卵子 / DNA修復 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ブタ卵子や受精卵の超低温ガラス化保存技術は、改良増殖や遺伝子資源の保存の面から非
常に重要である。しかし、ブタ卵子をガラス化保存した場合の、発生能の低下やその原因については不明な点が多く残されており、医学研究において急速に重要性が高まっているゲノム編集技術の材料の提供手段として利用されるには至っていない。本研究では、ゲノム編集技術にも関連が深いDNA損傷修復機能に注目し、ガラス化保存がブタ卵子・受精卵にもたらすDNA 損傷とDNA修復機能が卵子のステージにどのように依存しているのかを明らかにし、ガラス化保存後のブタ卵子・受精卵を利用したゲノム編集胚を作出する。
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| 研究実績の概要 |
本研究は、ガラス化保存ブタ受精卵の効率的なゲノム編集を目的とした。加温2時間後の受精卵に対し、OCT4またはCD46遺伝子CRISPR/Cas9 RNPエレクトロポレーション（RNP-EP）を行った後、胚盤胞まで発生させた。胚盤胞ゲノムシーケンス解析の結果、OCT4（非ガラス化：91.0%、ガラス化：95.1%）とCD46（非ガラス化：94.5%、ガラス化：93.2%）のいずれも高効率でゲノム編集が確認され、非ガラス化とガラス化間で有意差は認められなかった。胚盤胞の免疫細胞染色ではOCT4およびCD46タンパク質は検出されず、それぞれの遺伝子がノックアウトされていることが示された。さらに、OCT4およびCD46ノックアウト胚盤胞はコントロールと比べてその体積が小さいことが分かった。そこで、RNP-EPによるストレス刺激が胚盤胞発生に及ぼす影響を調べるため、上述通り加温後の受精卵にRNP-EPを行い、培養6日目の胚盤胞の総細胞数を比較した。内在性遺伝子コントロールとしてEGFP-RNPを用いた。その結果、総細胞数はOCT4-RNP-EP (35.4±3.6)、CD46-RNP-EP (28.7±4.8)、EGFP-RNP-EP (57.5±4.1)、Non-RNP-EP (66.4±7.8)であった。すなわち、OCT4-RNP-EPおよびCD46-RNP-EP由来胚盤胞の総細胞数は、EGFP-RNP-EPおよびNon-RNP-EPと比べて有意に減少したが、EGFP-RNP-EPおよびNon-RNP-EP間において有意差は認められなかった。これらの結果は、RNP-EPによるストレス刺激は胚盤胞発生に影響を及ぼさないことを示しており、OCT4-RNP-EP、CD46-RNP-EP由来胚盤胞の体積と細胞数減少は、それぞれの遺伝子ノックアウトによる表現型を示唆するものである。
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