| 研究課題/領域番号 |
21K05941
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
翁長 武紀 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (90224261)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
3,380千円 (直接経費: 2,600千円、間接経費: 780千円)
2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | Xenin / 内分泌細胞 / オルガノイド / 胃オルガノイド / 小腸オルガノイド / 消化管ペプチド / 腸内分泌細胞 / 刺激分泌連関 / バイオセンサー |
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| 研究開始時の研究の概要 |
消化管ペプチドであるXeninの様々な作用が近年明らかにされてきたが、消化管内腔からその内分泌細胞を刺激する栄養素などの分泌調節因子は確定されていない。一方、消化管の内分泌細胞は粘膜上皮に散在しており、様々な細胞や神経系も混在していることから、その刺激分泌連関を調べるのは困難である。そこで、Xeninの内分泌細胞に富む細胞の集合体である消化管オルガノイドを開発し、蛍光共焦点顕微鏡下でのCa2+感受性色素による細胞応答や近接させたセンサー細胞の膜電流測定を利用した高感度測定系を開発してXeninの分泌刺激因子を細胞レベルで明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
昨年度の報告書に記載した今後の方針に基づいて①胃および②十二指腸粘膜をコラゲナーゼ処理で分散した細胞塊と、③十二指腸粘膜をCa2+キレート法により分散した細胞塊をそれぞれ48穴プレート内のマトリゲルに播種し、Satoら(2018)の報告に基づいたDMEM/F12を基本液とする通常の増殖用培養液で培養した。基本的に胃の細胞培養にはGastrinとFGF-10を添加し、十二指腸の細胞培養にはIGF-IとFGF-2を添加した。増殖用培養液にはマウスrecombinant Wnt3a（mr-Wnt3A）を使用した系とAfamin-Wnt3aを使用した系の2系列を調製し、a.増殖用培養液のみ、b.ニコチンアミド添加、c.ニコチンアミドおよびRHOK-inhibitorであるY-27632の添加条件で培養した。しかし、いずれにおいてもオルガノイドの形成はみられなかったため、途中で培養液のmr-Wnt3a、Afamin-Wnt3aおよびR-spondinの濃度を修正して培養を続けた。さらに新規に細胞を分離して、上記の2系統の基本培養液に加えてY-27632や、p38 MAP kinase inhibitorであるSB202190、GSK inhibitorであるCHIR 99021の添加の有無による細胞増殖への効果も検討したが、いずれもオルガノイドの形成には至らなかった。
そこで、上記の無血清培地ではなく、10%ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12とL-WRN(Wnt, R-spondin, Noggin)調整培養液を混和したMiyoshiら(2013)の培養方法を基本として、上記の3因子の添加の有無を比較する方法でも同様に検討したが、やはり内分泌細胞に富むオルガノイドを誘導できなかった。培養実験は何れも複数回行ったが、目的とするようなオルガノイドの作製まで至っていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究において内分泌細胞に富むオルガノイドが誘導できない原因が現時点では明確に分かっていない。多くの先行研究がマウス細胞を用いて進められてるが、本研究ではラットで同様に内分泌細胞に富むオルガノイドの開発を計画した。実験手法に関してはマウスの既報に於ける方法にほぼ忠実に従って進めてきたが、うまくオルガノイドの分化を誘導できておらず、その原因が刺激因子の種差によるのか、使用している成長因子の種差や試薬の種差や製品ロットの違いに起因するのか原因まで検証できていない。本研究では摘出した胃腸組織からの初代培養が基本だが、iPS細胞から胃オルガノイドを分化させる既報の培養条件なども参考にしながら引き続き培養条件の検討を進める。
本申請研究ではXeninの内分泌細胞に富む消化管オルガノイドの開発と併せて、蛍光共焦点顕微鏡下でのCa2+感受性色素による細胞応答や近接させたセンサー細胞の膜電流測定を利用した高感度測定系の開発も予定していたが、オルガノイド自体の誘導が順調に進んでいないため、高感度測定系の開発まで並行して進めきれなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
オルガノイドを分化させる条件について、マウスの既報に準じた方法がラットにうまく適用できていないので、消化管上皮細胞の初代培養方法の基本に立ち戻って培養条件を検討し直す。既報のヒトを含めた動物種のオルガノイドの作製方法において調節因子となるシグナルは限られていることから、それらの組合せる条件がラットに合致していないものと推測される。また、実験書によれば試薬のメーカーやロットは培養効率に影響しないという記述がある一方で、基本培養液の緩衝液や抗生物質、アミノ酸液のメーカーが違うと培養がうまくいかないという説明もあり、すでに購入した高価な試薬類を全て替えることはできないものの、主要な増殖シグナルとなる成長因子等の試薬の入れ替えを検討する。主要な論文で使用されて来なかったので本研究ではこれまで使用しなかったが、既報によって影響する可能性が示唆される刺激または抑制因子の添加も検討する。何より1回の培養に結構な期間を要するため、複数の条件検討を平行して進め時短を図る。
また、当初はXeninに結合するニューロテンシン1型受容体 (NTR1)を発現する胃平滑筋細胞のオルガノイドをXenin分泌の検出のためのバイオセンサーとして開発する予定であったが、オルガノイド自体の誘導が滞っているため、既存のNTR-1を発現する市販の株化細胞を利用したバイオセンサーの開発も視野に入れて測定系の確立を進める。
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