| 研究課題/領域番号 |
21K05948
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42020:獣医学関連
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| 研究機関 | 熊本高等専門学校 |
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研究代表者 |
吉永 圭介 熊本高等専門学校, 生産システム工学系BCグループ, 准教授 (30513238)
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| 研究分担者 |
大場 真己 東京農工大学, 農学部, 特任准教授 (30816559)
水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | セルパンニング / インターナライズ / パラトープ解析 / VeroE6 / 発現レベルの向上 / セレクション法の改良 / 凸面ライブラリの構築 / FIPV結合性クローン / ウイルス分離 / 分離困難ウイルス / スパイクアダプター法 / FIPV / Vero細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
ウイルス感染症の病態解明やワクチン開発において対象となるウイルスを分離・クローン化することが重要である。従来、ウイルスによって分離に用いられる細胞は異なるが、Vero細胞のように扱いやすい細胞で分離細胞を一本化できれば、分離工程を簡素化、標準化でき、分離困難ウイルスや受容体未同定ウイルスも分離可能になる。
本研究は、ウイルスとVero細胞それぞれに特異的に結合するアダプターを作製し、宿主の変換が可能かを検証することが目的である。そのために、1:Vero細胞に感染できないウイルスであるFIPVをモデルに、ヤヌス化LRR抗体で実際にアダプター分子を複数種類作製し宿主変換ができるかを検証する。
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| 研究実績の概要 |
令和４年度は、令和３年度に発現向上を目指してN末端領域をフォールディングしやすい配列に改良した凸面ライブラリと、研究分担者によって調製されたFIPVを用いて、FIPV結合クローンのセレクションを３ラウンドおこなった。セレクション時は、使用するブロッキング剤、結合クローンの溶出法の改良をおこなった。その結果FIPV結合クローンが8種類得られ、ELISAによるFIPV結合活性、クローンの塩基配列解読をおこなった。クローンの抗原結合部位（パラトープ）のアミノ酸配列の解析からパラトープの配列の特徴がわかった。
凹面ライブラリについても、インバースPCRを応用した方法でライブラリ構築を完了させ、ライブラリの評価をおこなった。セレクションに使用する培養細胞（VeroE6）の系を立ち上げた。VeroE6に結合およびインターナライズするクローンのセレクションを２ラウンドおこなったところ、実際にVeroE6細胞内からファージを回収することができた。現在、クローンのパラトープ解析のために必要な塩基配列解析をおこなっている。さらに各クローンについてVeroE6細胞へのインターナライズ活性の定量的評価をおこなっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では年度内に、細胞にインターナライズするクローンのセレクションと解析、凹面/凸面クローンのカップリング（ヤヌス化）、ヤヌス化後の結合能解析の予定であったが、諸般の事情によりクローンの取得に時間を要しヤヌス化まで到達できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
FIPV結合クローンの凸面と、VeroE6インターナライズクローンの凹面を遺伝子レベルでカップリング（ヤヌス化）する。ヤヌス化後のクローンについて、FIPV結合能、VeroE6へのインターナライズを確認する。両性質を保持していた場合、FIPVをVeroE6に感染（または導入）させることが可能かを解析する。
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