| 研究課題/領域番号 |
21K06001
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分42040:実験動物学関連
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
北村 浩 酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (80312403)
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| 研究分担者 |
岡村 匡史 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 実験動物管理室長 (00333790)
江口 暁子 三重大学, 医学系研究科, 特任准教授(研究担当) (00598980)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | ユビキチン / USP / USP2 / NASH / NAFLD / 骨格筋 / メタボリックシンドローム / 筋萎縮 / 筋委縮 / 臓器間クロストーク |
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| 研究開始時の研究の概要 |
新たな生活習慣病として社会的な問題となっているNFLD/NASHに対する各臓器でのUSPの役割を遺伝子改変マウスを用いて明らかにする。特にこれまで研究代表者が2型糖尿病など生活習慣病の制御分子としての役割を示してきたUSP2を中心に調べる。即ち、全身および細胞選択的Usp2遺伝子欠損マウスを駆使して、１）全身および２）骨格筋や肝臓でのUSP2のNASH病態における役割を明らかにすると共に、３）視床下部、骨格筋、肝臓などの臓器間のクロストークにおける各臓器のUSP2の役割を明らかにする。またNAFLD/NASHに関わる新たな候補USPを発現解析を基に探索し、これらの改変マウスを作製する。
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| 研究実績の概要 |
1)前年までに筋選択的Usp2ノックアウト(KO)マウスにメチオニン・コリン欠損高脂肪餌（CDAHFD）を給餌したときに、骨格筋で発現が増加する分子Xを見出した。この分子はミトコンドリアの新生に関わることからUsp2遺伝子の欠損を代償する可能性を考えた。そこでX遺伝子のKOマウスを入手し、戻し交配を繰り返すことで、C57BL/6バックグラウンドのX遺伝子KOマウスを作成した。更にUsp2KOマウスと交配することでXとUsp2を双方欠損するX・Usp2 dKOマウスを樹立した。現在、X・Usp2 dKOマウスにCDAHFDを給餌し、表現型解析を進めている。また培養筋細胞を用いて、XとUSP2の関係を調べたところ、Xタンパク質はUsp2遺伝子の発現を変動させることを見出した。Usp2KOマウスの骨格筋でのX遺伝子の発現増加はUsp2の誘導を促すフィードバック制御であることが示唆された。
2)前年度にUsp2KOマウスにCDAHFDを給餌し、10週間後には骨格筋の有意な異常（形態学的変化・握力）は認められなかったため、給餌期間を1ヵ月に短縮した。体重や摂餌量などに大きな変化は見られなかったが、短時間絶食時の血糖値や握力が野生型と比べ有意差が認められた。
3)CDAHFD給餌2、４，10週間後に骨格筋(ヒラメ筋、腓腹筋）や肝臓で遺伝子発現が変動するUSPを網羅的なqRT-PCR法で探索し、複数見出した。
4)ヒトのNAFLD/NASHの場合、多くが2型糖尿病を併発することから、Usp2KOマウスに実験的に2型糖尿病を誘発した。予備的知見ではあるが、骨格筋で酸化ストレスの蓄積がみられた。
5) USP2の化学阻害剤を視床下部腹内側核に投与した場合、血糖値が上昇するが、これが腹内側核ニューロンの活性酸素の蓄積とそれに伴う交感神経の活性化により肝臓でのグリコーゲン分解によることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）CDAHFD長期給餌後、Usp2KOマウスでは顕著な骨格筋の形態機能学的な変化が認められなかったが、この時、代償的に誘導される遺伝子Xを見出し、遺伝子XとUsp2遺伝子を双方欠損するマウスの作出までできたので、予定以上の進捗がみられた。
２）短時間のCDAHFD給餌で野生型でみられない変化がUsp2KOマウスの肝臓や骨格筋で認められたことから、NASH時の肝臓に加えて骨格筋の機能におけるUSP2の役割を明らかにするという本課題の目的の答えとなる知見が得られた。
３）CDAHFDモデルでは肝臓の中性脂肪の蓄積は顕著であるが、肥満・インスリン感受性の変化などヒトのNAFLD/NASHでみられる変化が認められない。そこでよりヒトのNAFLD/NASH患者の病態に近い2型糖尿病モデルを用いた検討を実施したところ、USP2が病態に関わることを示す予備的知見を得た。このことはヒトNAFLD/NASH患者の肝・筋機能異常の進行決定分子としてのUSP2の役割を示唆するものである。
４）NAFLD/NASHモデルで骨格筋・肝臓での機能異常に対するUSP2の役割は明らかにされつつあるが、肝-筋及び筋-肝クロストークは依然明確でない。
５） USP2の化学阻害剤を視床下部腹内側核に投与した場合、血糖値が上昇するが、これが腹内側核ニューロンの活性酸素の蓄積を促すことを明らかにした。更に蓄積した酸化ストレスが腹内側核ニューロンAMPKのリン酸化を進めることで交感神経を活性化し、肝臓でのグリコーゲン分解を促すことも見出した。このような視床下部のUSP2による血糖調節機構を解明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）Usp2KOマウスでは1ヵ月間といった短期のCDAHFD給餌で空腹時の血糖値と前肢の筋力で変化が認められたことから、これらの臓器に機能変化を担う分子を探索する。特に肝臓での糖新生酵素をUSP2が遺伝子発現レベルで制御するという報告があることから、これらのの遺伝子発現や酵素活性の変化が血糖値に与える効果を調べる。またトランスクリプトミクスから骨格筋の機能低下に関わる肝由来分子を探索し、肝-筋クロストークを明らかにする。
２）X・Usp2 dKOマウスにCDAHFDを与えたときに、X KOマウスと比べ、肝臓の形態および機能（形態像、遺伝子発現、糖代謝酵素の発現、伊東細胞・肝細胞・免疫細胞数）と骨格筋の形態及び機能（握力、筋線維組成、ミトコンドリアの形態、酸素消費）について調べる。
３）2型糖尿病を誘発した筋選択的Usp2KOマウスで見出された筋機能異常の再現実験を進める。これまでに培養筋芽細胞のUsp2の欠損は酸化ストレスの蓄積が認められることを報告したが、糖尿病処置した成熟筋細胞における酸化ストレスの程度を野生型マウス、筋選択的Usp2KOマウスで比較する。さらに活性酸素の蓄積が、活性酸素除去系の不全なのか、活性酸素産生系の活性化なのかを明らかにする。またマイオカインの発現レベルを調べることで筋-肝クロストークへの影響を調べる。
４）CDAHFD給餌で肝臓や骨格筋で発現変動するUSPのKOマウスをCRISPR/Cas9法で作成する。
５）NAFLD/NASHの進行と関連する血糖値調節に視床下部USP2が関与することを明らかにできた。
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