ES細胞を用いない新規のコンディショナルな遺伝子機能欠失誘導マウスの開発と展開

研究課題

研究課題/領域番号	21K06002
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分42040:実験動物学関連
研究機関	北里大学
研究代表者	渡邉大介北里大学, 理学部, 講師 (00260175)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円) 2024年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円) 2023年度: 780千円 (直接経費: 600千円、間接経費: 180千円) 2022年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円) 2021年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
キーワード	コンティショナルレスキュー法 / コンディショナルノックアウトマウス / inversin 遺伝子 / c-kit 遺伝子 / Sl 遺伝子 / 疾患モデルマウス / c-kit Sl 遺伝子 / コンディショナルレスキュー法 / Inv遺伝子 / c-kit,　sl　遺伝子 / 疾患モデル動物
研究開始時の研究の概要	本研究では、改良を加えたベクターによって新規のコンディショナルレスキューマウス(cRマウス)を作製し、Inv遺伝子ならびにSlやc-kit遺伝子の発現を組織または発生時期特異的に欠失させ、生体におけるそれぞれの遺伝子の機能を明らかにする。このベクターで作製するcRマウスでは正常な細胞と目的の遺伝子を欠失した細胞とを蛍光蛋白質の発現を指標としてモニタリングが可能となるため、それぞれの遺伝子の左右軸の決定や腎形成ならびに造血幹細胞や生殖幹細胞の増殖や分化における機能をin vivoやin vitroの実験系において明らかにする。またこれらの新規の実験手法を確立する。
研究実績の概要	組織特異的な機能を有した遺伝子の解析にはコンディショナルノックアウトマウスをもちいた解析が一般的であるが、その作成には目的とする遺伝子の改変がなされたES細胞の樹立やその後のキメラマウスの作成に特殊な技術や多くの時間が必要とされる。またこの方法ではES細胞が樹立されていないマウス系統での解析は困難である。我々はこの問題を解決する目的でコンディショナルレスキュー法を開発した。この手法ではES細胞を必要としないため、コンディショナルノックアウトマウス法と比へて、簡便かつ低コストで目的とする遺伝子の組織または発生時期特異的な機能の解析か可能である。さらにES細胞が確立されてないマウス系統やマウス以外の動物にも適応可能な新規の技術となっている(特許第6327712)。昨年度までの研究においては2種類の蛍光タンパク質を指標とし、レスキュー遺伝子の発現を可視可する第２世代のベクター系の開発し、実際にこれらのベクター系をもちいて造血幹細胞など多くの幹細胞の増殖や分化において重要な働きを有したリガンド分子であるsteel(sl)遺伝子のほか、新たにそのレセプターであるc-kit遺伝子対するコンディショナルレスキューマウスの系統の樹立を進め、現在までに遺伝子が導入されたマウス系統をそれぞれ複数系統得ることに成功した（文部科学省新学術領域研先端モデル動物支援プラットフォーム支援）。また平行してこれまでに作成を終えたコンディショナルレスキューマウスの組織特異的、また発生時期特異的な遺伝子機能の解析に必要とされるP0-Cr, ER2-Cre等のトランスジェニックマウス系統の遺伝子背景を交配実験に必要とされる目的の遺伝子背景へと変換を進めた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由これまでに作成した、初代型のコンディショナルレスキューマウスと同様に、第２世代のコンディショナルレスキューベクターをもちいて作成された新規のコンディショナルレスキューマウスにおいても、sl c-kit遺伝子変異マウスで観察される、メラノサイトの移動障害を原因とする毛色の白色化がレスキューされ、毛色が黒色化したコンディショナルレスキューマウス系統が確認されている。これら結果は我々が開発したコンディショナルレスキュー法が一般的な多くの遺伝子に対しても有効的に機能する手法であることを証明する結果となった。
今後の研究の推進方策	今年度も引き続きコンディショナルレスキュー遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスより、目的とする機能を有したslならびにc-kit遺伝子に対するコンディショナルレスキューマウス系統の樹立を進める。さらに得られたコンディショナルレスキューマウスと特異的Cre発現マウス系統との間で交配を進め、得られたF1マウスの解析により、これら遺伝子の組織特異的また発生時期特異的な機能の解析を進める。その他コンディショナルレスキューマウスの作成効率を高めるため、Rosa26遺伝子領域などの安定的な遺伝子の発現が期待される領域にCRISPR-Cas9システムをもちいて簡便にコンディショナルレスキューベクターをノックインする新たな手法の開発を進める。