| 研究課題/領域番号 |
21K06016
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43010:分子生物学関連
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| 研究機関 | 大阪大学 (2022)
京都大学 (2021) |
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研究代表者 |
谷口 一郎 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任助教(常勤) (00467432)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | RNA核外輸送 / RNP / RNP remodeling / RNA export / RNA helicase |
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| 研究開始時の研究の概要 |
RNAヘリカーゼのUAP56が試験管内反応系において、核内低分子RNAの核外輸送複合体の形成を促進すること、および、新生mRNA-タンパク質複合体の解体を促進することを見出した。UAP56によるRNP再編成の分子機構を明らかにするため、UAP56の変異体を用いて試験管内反応系において解析を行う。また、細胞内でも再編成活性があることを検証するため、ノックダウンや変異体の発現した培養細胞を用いて、生化学および細胞生物学的手法を利用する。また、RNAヘリカーゼの新規標的RNPを網羅的に探索する方法を開発するため、UAP56に焦点を絞り、結合タンパク質とRNAを生化学的に同定する。
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| 研究実績の概要 |
真核細胞のmRNAは核内で合成された後、一群のRNA結合タンパク質とともにhnRNPと呼ばれる複合体を形成する。その後、核外輸送タンパク質因子群がmRNAに結合することによってmRNAは細胞質へ輸送される。mRNA核外輸送において、別種のU snRNAの核外輸送因子PHAXがmRNAに結合して、その結果、誤った経路で輸送される可能性が考えられた。我々は以前、PHAXのmRNA結合を防ぐ仕組みとして、hnRNP構成タンパク質因子であるhnRNPCのmRNAへの結合が重要であることを報告した。PHAXのmRNA結合の阻害後には、hnRNPCのmRNAからの解離がmRNA核外輸送に重要であることも示した。ただし、hnRNPCのmRNAからの解離の仕組みは不明である。当該年度では、解離の仕組みを明らかにする目的で、hnRNPCの活性に焦点を絞って解析を行った。スプリントライゲーション法を利用した試験管内RNA-タンパク質結合実験系を構築することによって、hnRNPCがmRNAの5'末端のキャップ構造から隙間なくRNAに結合すること、さらに、その結合にはキャップ結合タンパク質複合体CBCが必要であることを示した。また、アフリカツメガエル卵母細胞への顕微注入実験によって、生細胞においてhnRNPCの4量体形成がU snRNA核外輸送経路利用の抑制に重要であることを示した。以上の結果を国際雑誌Nucleic Acids Research誌で発表した。
mRNA核外輸送とは対照的に、U snRNA核外輸送に関与するRNAヘリカーゼは未知である。これまでにUAP56を候補因子として同定していた。当該年度では、試験管内反応系を構築することにより、UAP56がATP依存的にPHAXのRNA結合を促進することがわかった。また、PHAXとUAP56を含む新規タンパク質複合体を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
hnRNPCはmRNAに結合することによってPHAXのmRNA結合を阻害するが、その詳細なメカニズムは不明であった。この問題を解明するため、さまざまなhnRNPC変異体の組換えタンパク質を精製し、独自の試験管内RNA-タンパク質結合実験を行った。その結果、CBCとhnRNPCがmRNA上で直接相互作用することを明らかにした。また、両タンパク質因子間の相互作用により、hnRNPCはキャップ構造から隙間なくmRNAに結合することを示した。さらに、試験管内および細胞内RNA-タンパク質結合実験を行い、hnRNPCの4量体形成がそのRNA結合に必要であることと、hnRNPCによるPHAXのmRNA結合阻害に重要であることを明らかにした。以上の結果から、hnRNPCによるPHAX阻害の詳細なメカニズムを示すことができた。以上の解析とあわせて、さまざまなRNAの3'末端形成を制御するARS2に関して、そのmRNA結合をhnRNPCが阻害するという新規活性を見出した。これらの成果を論文発表するに至った。
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| 今後の研究の推進方策 |
試験管内反応系を構築することにより、hnRNPCのRNAからの解離を促進する候補因子としてUAP56を同定している。今後は細胞内においてUAP56が解離するかを検証する。そのために、UAP56ノックダウンや機能欠損変異体の過剰発現によって、細胞内のhnRNPCのmRNA結合が増強するかを調べる。細胞内のhnRNPCのRNA結合に関しては、紫外線クロスリンクとmRNAプルダウン実験を組み合わせた実験を行う。また、構造学的解析を行うことにより、UAP56によるHNRNPCの解離の仕組みを明らかにする。具体的には、UAP56がHNRNPCを1分子のRNAから解離する様子を高速原子間力顕微鏡を利用して観察する。また、HNRNPCとRNAとの複合体の単粒子解析を行う。
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