| 研究課題/領域番号 |
21K06044
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 基金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 審査区分 |
小区分43020:構造生物化学関連
|
|---|
| 研究機関 | 順天堂大学 |
|---|
研究代表者 |
児玉 昌美 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (30512248)
|
|---|
| 研究分担者 |
小川 治夫 京都大学, 薬学研究科, 准教授 (40292726)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
|
| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
|
|---|
| キーワード | グアニル酸シクラーゼ受容体 / ナトリウム利尿ペプチド / GCase受容体 |
|---|
| 研究開始時の研究の概要 |
グアニル酸シクラーゼ(GCase)受容体とリガンドであるナトリウム利尿ペプチド(NP)によって構成されるNP系は、血圧・体液バランスの維持に不可欠である。申請者らは二量体GCase受容体の細胞外リガンド結合(LB)ドメインにNPが結合すると、LBドメインが旋回することを明らかにし、この旋回運動こそが細胞内GCaseドメインの活性化を惹起するカギであると考えている。本研究では、旋回運動に主眼を置いてGCase受容体の構造解析を行い、GCase受容体が①リガンドを認識する機構と②結合シグナルを膜内に伝達し、GCaseドメインを活性化する機構を明らかにする。
|
| 研究実績の概要 |
グアニル酸シクラーゼ（GCase）受容体は、細胞外にリガンド結合（LB）ドメインを、細胞内にGCaseドメインを持ち、2量体として機能する。私たちはこれまでに、血圧・体液バランスの維持に不可欠なGC-A受容体について、LBドメインと心房型ナトリウム利尿ペプチド（ANP）の複合体のX線結晶解析を行い、2量体LBドメインの中心にANP１分子が結合し、LBドメインを旋回させることを明らかにした。本研究は、旋回運動に主眼を置いてGCase受容体の①リガンドを認識する機構と②結合シグナルを膜内へ伝達し、GCaseを活性化する機構を明らかにすることを目的としている。
これまでにGC-A受容体のLBドメイン・C末端欠損変異型ANP複合体の構造解析では、LBドメインの旋回角度に違いを見出したが、独自開発した、Blue-native PAGEを用いた「リガンド結合による受容体の二量体形成を直接観察可能な系」において、欠損変異型ANPは受容体に対する結合親和性も低下していることが明らかになっており、構造解析で見出した旋回角度の違いがGCase活性に与える影響を正しく評価するためには、GCase活性のキネティックス解析が不可欠であった。しかしGCase活性測定のためのcGMPの定量には、ELISAのように時間的、金銭的にコストの大きい手法を用いてきたことから、GC-A受容体の誘導発現細胞株にcGMPのバイオマーカーを構成的に発現させることによって、低コストでリアルタイムにかつ簡便にGC活性を比較できる系をおおむね確立した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、Blue-native PAGEを用いた「リガンド結合による受容体の二量体形成を直接観察可能な系」を独自に開発することで、リガンドの受容体に対する結合親和性の簡便な評価を可能にしたが、GCase活性を簡便に評価する系がなかったため、構造解析で見出した旋回角度の違いが有する生物学的意義を正しく評価することが出来ずにいた。今回、GCase活性を簡便に評価できる系を得られたことで、構造解析の結果を正しく評価し、効率的に研究を進められる見通しがついた。またGCase活性の評価に用いたバイオマーカーは、簡単な精製でin vitroにおけるcGMPの定量にも応用できることを確認している。今後、全長GCase受容体に対してクライオ電顕による構造解析を行うことを予定しており、構造解析に用いる精製受容体に活性の有無を確認する手法として用いることを検討中である。cGMPの定量のためのELISA法は、時間的、金銭的コストが大きいことがネックになっていたが、これらの問題が解決し、研究のさらなる推進が見込めることから、進捗状況はおおむね順調であると評価した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
GC-A受容体のLBドメイン・ANP複合体のＸ線結晶解析において、これまでに得られた知見を原著論文として発表するなどし、研究の成果を広く社会に還元することに尽力する。
変異型ANPについて、開発したcGMPバイオセンサーを用いたGCase活性のキネティックス解析系を用いて、GCase活性を測定し、すでに得ている構造解析の結果と照合することで、GC-A受容体のLBドメイン・C末端欠損変異型ANP複合体の構造解析で見つけた構造の違いが有する生物学的意義を検証する。近年では、GC-A受容体の活性化を促すANP様の合成ペプチドの開発や、ANPによるGC-A受容体の活性化を亢進する化合物のスクリーニングが報告されている。合成ペプチドの中には組織特異的に活性を示すものの報告もあり、活性化の分子基盤が興味深い。GCase活性のキネティックスを解析し、興味深い結果が得られれば、GC-A受容体と合成ペプチドの複合体の構造解析を行うことで新たな知見が得られるのものと期待している。
本研究は細胞内GCaseドメインも含めた全長GC-A受容体とNPの複合体の構造解析へと繋げることを目的としている。今回用いているcGMPのバイオセンサーは、in vitroでのGCase活性の測定にも用いることができるため、活性測定を並行して行うことで、活性を保ったまま全長GC-A受容体を精製できる方法を探索し、研究を進展させたい。
|
