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トリプトファンプレニル基転移酵素のペプチド基質認識と反応機構の構造学的解明

研究課題

研究課題/領域番号 21K06051
研究種目

基盤研究(C)

配分区分基金
応募区分一般
審査区分 小区分43020:構造生物化学関連
研究機関横浜市立大学

研究代表者

浜田 恵輔  横浜市立大学, 医学部, 助教 (00344052)

研究分担者 仙石 徹  横浜市立大学, 医学部, 准教授 (60576312)
緒方 一博  横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (90260330)
研究期間 (年度) 2021-04-01 – 2025-03-31
研究課題ステータス 交付 (2023年度)
配分額 *注記
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 390千円 (直接経費: 300千円、間接経費: 90千円)
2022年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2021年度: 2,470千円 (直接経費: 1,900千円、間接経費: 570千円)
キーワードプレニル基転移酵素 / 酵素反応機構 / 酵素基質特異性 / X線結晶構造解析 / ペプチド創薬 / 基質特異性
研究開始時の研究の概要

ペプチドは医薬品リード化合物として高い利用価値を秘めているが、一般に膜透過性や生体内での安定性が低いという欠点を持つ。一方、天然由来のペプチドには、プレニル化などの翻訳後修飾により、高い膜透過性を持つものが存在する。特に、トリプトファンのインドール環のプレニル化は、ペプチドの膜透過性に加えてプロテアーゼ耐性などの向上に寄与することが想定される。本研究では、ペプチドを基質とするトリプトファンプレニル基転移酵素の結晶構造解析を行い、生化学実験と分子動力学解析をあわせて、その基質特異性と反応機構を解明する。研究成果は、膜透過性などの体内動態に優れた次世代の特殊ペプチド取得技術の開発に有用である。

研究実績の概要

ペプチド創薬において、ペプチドの膜透過性やプロテアーゼ耐性をいかに付与するかが課題となっている。プレニル基転移酵素によるペプチドのプレニル化は、その解決法の一つに挙げられる。しかし、酵素の基質認識機構や反応機構の理解が十分進んでいないため、リード化合物検索に用いるプレニル化ペプチドライブラリーの構築に対する妨げとなっている。
微生物由来の酵素KgpFや新規酵素X(未発表のため仮名)は、ペプチド中のトリプトファンを基質とし、膜透過性向上が期待されるプレニル化ピロロインドリンを生成する。興味深いことに、両酵素は異なる基質選択性を持ち、立体化学的に異なる生成物を作り分ける。一方、新規酵素LimFはペプチド中のヒスチジンを基質とし、ゲラニル基を付加することで、ペプチドの疎水性度の向上に寄与する。
本研究では、これら酵素による基質認識の構造基盤を明らかにするため、酵素-プレニル基供与体アナログ(ジメチルアリルチオ二リン酸、DMASPPあるいはゲラニルチオ二リン酸、GSPP)-基質ペプチド複合体のX線結晶構造解析を推進した。
これまでに、我々は酵素X-DMASPP-基質ペプチド三者複合体、およびLimF-GSPP-基質ペプチド三者複合体の結晶構造をそれぞれ1.5Å、1.9Å分解能で明らかにした。その結果、酵素Xは触媒に必須なGlu残基が基質ペプチドのトリプトファンインドール環のNH基を直接認識していた。また、このインドール環は、類縁酵素間で保存性が低い複数の残基とのファンデルワールス接触により特異的に認識されることが明らかになった。一方、LimFは触媒に必須なGlu54とHis172が基質ペプチドのイミダゾール環の1位および3位窒素をそれぞれ直接認識することで、ゲラニル化の標的部位である2位炭素をプレニルドナー側へ配向させることが明らかになった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究では、基質ペプチドのトリプトファンを特異的にプレニル化する酵素KgpF、および新規酵素Xに着目し、その基質認識機構と触媒機構を明らかにすることを目的とする。現在までに、KgpFおよび酵素Xを用いて、酵素-DMASPP-基質ペプチド複合体のX線結晶構造解析を進めてきた。酵素Xにおいては、5残基からなる活性に最適な基質ペプチドを用いて、酵素X-DMASPP-基質ペプチド複合体の結晶化に成功し、X線結晶構造解析を1.5Åの分解能で行った。その結果、酵素Xによる基質認識機構を明確にすることができた。
一方、KgpFにおいては、基質として許容されるペプチド配列の条件を絞り込み、基質ペプチドのトリプトファンの一つ前のアミノ酸が最も修飾効率に影響することを生化学的解析により明らかにした。この結果を基に、KgpFとの共結晶化用に複数種類のペプチドを合成した(研究協力者による)。現在、結晶化条件の探索を進めている。我々は準備段階として、基質ペプチドを欠いたKgpF-DMASPP二者複合体の分子構造を1.9Åの分解能で決定しているので、目的の結晶が得られれば、分子置換法により迅速に構造決定できると予想される。
さらに、我々はトリプトファンプレニル基転移酵素の研究に並行して、新規酵素であるヒスチジンプレニル基転移酵素LimFを同定し、プレニル基供与体アナログ(GSPP)と5残基からなる基質ペプチドとの複合体のX線結晶構造解析に成功し、基質特異性および基質認識機構を明らかにした。
酵素XとLimFの構造比較から、これらの酵素は類似した立体構造を持つが、異なるプレニル基供与体の選択性や基質ペプチド中の標的アミノ酸認識の特異性を示す構造的理由を明らかにすることができた。

今後の研究の推進方策

1)酵素-プレニル基供与体アナログ-基質ペプチド複合体の構造解析
上記のKgpFに特化した合成ペプチドを用いて、KgpF-DMASPP-ペプチド複合体の共結晶化条件の探索を進める。共結晶が析出しなかった場合、例えばKgpFのC末端にこのペプチドを融合させた変異体を作製し、分子内会合によってKgpFの活性部位にペプチドが結合することを期待して結晶化を試す。
2)各種変異体の機能解析
KgpFと酵素Xの分子構造から触媒基や基質ペプチドの認識に関わるアミノ酸の変異体を作製する。これら各種変異体の活性測定をLC/MSを用いて行い、各アミノ酸の活性への影響を調べる。これらの機能解析から基質特異性や反応機構を明らかにする。
3)分子動力学シミュレーション
KgpFと酵素Xでは基質ペプチド中のトリプトファンの一つ前のアミノ酸が修飾効率に大きく影響するが、それに加えて、トリプトファンの一つ後ろにはプロリンを好まない。トリプトファン前後に存在するアミノ酸が酵素-基質複合体の安定性に与える影響を分子動力学的シミュレーションにより検討する。ペプチド配列を改変させたモデル構造を用いて、短時間(100-1000ナノ秒)での構造的ゆらぎや結合自由エネルギーを計算する。

報告書

(3件)
  • 2023 実施状況報告書
  • 2022 実施状況報告書
  • 2021 実施状況報告書
  • 研究成果

    (12件)

すべて 2023 2022 2021 その他

すべて 雑誌論文 (10件) (うち国際共著 4件、 査読あり 10件、 オープンアクセス 6件) 学会発表 (1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] A missense variant at the RAC1-PAK1 binding site of RAC1 inactivates downstream signaling in VACTERL association2023

    • 著者名/発表者名
      Seyama Rie、Nishikawa Masashi、Ogata Kazuhiro、Nagata Koh-ichi、Matsumoto Naomichi
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 13 号: 1 ページ: 9789-9789

    • DOI

      10.1038/s41598-023-36381-0

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Stretch-activated ion channel TMEM63B associates with developmental and epileptic encephalopathies and progressive neurodegeneration2023

    • 著者名/発表者名
      Vetro Annalisa et al
    • 雑誌名

      The American Journal of Human Genetics

      巻: 110 号: 8 ページ: 1356-1376

    • DOI

      10.1016/j.ajhg.2023.06.008

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Switching Prenyl Donor Specificities of Cyanobactin Prenyltransferases2023

    • 著者名/発表者名
      Zhang Yuchen、Hamada Keisuke、Satake Masayuki、Sengoku Toru、Goto Yuki、Suga Hiroaki
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 145 号: 44 ページ: 23893-23898

    • DOI

      10.1021/jacs.3c07373

    • 関連する報告書
      2023 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Three KINSSHIP syndrome patients with mosaic and germline AFF3 variants2023

    • 著者名/発表者名
      Inoue Yuta、Tsuchida Naomi、Okamoto Nobuhiko、Shuichi Shimakawa、Ohashi Kei、Saitoh Shinji、Ogawa Atsushi、Hamada Keisuke、Sakamoto Masamune、Miyake Noriko、Hamanaka Kohei、Fujita Atsushi、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Mizuguchi Takeshi、Ogata Kazuhiro、Uchiyama Yuri、Matsumoto Naomichi
    • 雑誌名

      Clinical Genetics

      巻: 103 号: 5 ページ: 590-595

    • DOI

      10.1111/cge.14292

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [雑誌論文] LimF is a versatile prenyltransferase for histidine-C-geranylation on diverse non-natural substrates2022

    • 著者名/発表者名
      Zhang Yuchen、Hamada Keisuke、Nguyen Dinh Thanh、Inoue Sumika、Satake Masayuki、Kobayashi Shunsuke、Okada Chikako、Ogata Kazuhiro、Okada Masahiro、Sengoku Toru、Goto Yuki、Suga Hiroaki
    • 雑誌名

      Nature Catalysis

      巻: 5 号: 8 ページ: 682-693

    • DOI

      10.1038/s41929-022-00822-2

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Structural basis of transcription regulation by CNC family transcription factor, Nrf22022

    • 著者名/発表者名
      Sengoku Toru、Shiina Masaaki、Suzuki Kae、Hamada Keisuke、Sato Ko、Uchiyama Akiko、Kobayashi Shunsuke、Oguni Asako、Itaya Hayato、Kasahara Kota、Moriwaki Hirotomo、Watanabe Chiduru、Honma Teruki、Okada Chikako、Baba Shiho、Ohta Tsutomu、Motohashi Hozumi、Yamamoto Masayuki、Ogata Kazuhiro
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Research

      巻: 50 号: 21 ページ: 12543-12557

    • DOI

      10.1093/nar/gkac1102

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] De Novo Discovery of Thiopeptide Pseudo-natural Products Acting as Potent and Selective TNIK Kinase Inhibitors2022

    • 著者名/発表者名
      Vinogradov Alexander A.、Zhang Yue、Hamada Keisuke、Chang Jun Shi、Okada Chikako、Nishimura Hirotaka、Terasaka Naohiro、Goto Yuki、Ogata Kazuhiro、Sengoku Toru、Onaka Hiroyasu、Suga Hiroaki
    • 雑誌名

      Journal of the American Chemical Society

      巻: 144 号: 44 ページ: 20332-20341

    • DOI

      10.1021/jacs.2c07937

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Amelioration of a neurodevelopmental disorder by carbamazepine in a case having a gain-of-function GRIA3 variant2022

    • 著者名/発表者名
      Hamanaka Kohei、Miyoshi Keita、Sun Jia-Hui、Hamada Keisuke、Komatsubara Takao、Saida Ken、Tsuchida Naomi、Uchiyama Yuri、Fujita Atsushi、Mizuguchi Takeshi、Gerard Benedicte、Bayat Allan、Rinaldi Berardo、Kato Mitsuhiro、Tohyama Jun、Ogata Kazuhiro、Shi Yun Stone、Saito Kuniaki、Miyatake Satoko、Matsumoto Naomichi
    • 雑誌名

      Human Genetics

      巻: 141 号: 2 ページ: 283-293

    • DOI

      10.1007/s00439-021-02416-7

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] De novo ATP1A3 variants cause polymicrogyria2021

    • 著者名/発表者名
      Miyatake Satoko、Kato Mitsuhiro、Kumamoto Takuma、Hirose Tomonori、他
    • 雑誌名

      Science Advances

      巻: 7 号: 13 ページ: 2368-2368

    • DOI

      10.1126/sciadv.abd2368

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Two families with TET3-related disorder showing neurodevelopmental delay with craniofacial dysmorphisms2021

    • 著者名/発表者名
      Seyama Rie、Tsuchida Naomi、Okada Yasuyuki、Sakata Sonoko、Hamada Keisuke、Azuma Yoshiteru、Hamanaka Kohei、Fujita Atsushi、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Mizuguchi Takeshi、Makino Shintaro、Itakura Atsuo、Okada Satoshi、Okamoto Nobuhiko、Ogata Kazuhiro、Uchiyama Yuri、Matsumoto Naomichi
    • 雑誌名

      Journal of Human Genetics

      巻: 67 号: 3 ページ: 157-164

    • DOI

      10.1038/s10038-021-00986-y

    • 関連する報告書
      2021 実施状況報告書
    • 査読あり
  • [学会発表] ペプチドヒスチジンプレニル基転移酵素による基質認識の構造基盤2022

    • 著者名/発表者名
      濱田恵輔
    • 学会等名
      日本蛋白質科学会
    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書
  • [備考] 横浜市立大学大学院 医学研究科 生化学教室

    • URL

      http://www-user.yokohama-cu.ac.jp/~seika/index.html

    • 関連する報告書
      2022 実施状況報告書

URL: 

公開日: 2021-04-28   更新日: 2024-12-25  

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