| 研究課題/領域番号 |
21K06077
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
藤原 孝彰 東北大学, 多元物質科学研究所, 助教 (70712751)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | 糖加水分解酵素 / 反応中間体 / X線自由電子レーザー / シリアルフェムト秒結晶構造解析 / 糖質関連酵素 / 動的構造解析 / セルロース |
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| 研究開始時の研究の概要 |
バクテリアセルロース(BC)は植物由来セルロースにはない固有の性質を有する生物素材として様々な分野で応用が期待されるが，実用化に向けて生産性の改善が必須である.糖加水分解酵素CeSZはBCの生産性に関わることが知られており，これまでに反応の一部を捉えた立体構造が得られている．本研究では，X線自由電子レーザーを用いた動的構造解析により，CeSZおよび糖基質の構造変化を可視化することで，CeSZによる加水分解反応の全容解明を目指す．そして，多様な糖加水分解酵素の反応機構を理解するための基盤を構築するとともに，合理的なBC生産プロセスの構築へと展開する.
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| 研究実績の概要 |
天然のハイドロゲルとして知られるバクテリアセルロース（BC）は，植物由来セルロースを凌駕する強度と保水性を有するほか，人工の合成高分子ゲルにはない生体適合性や生分解性などの優れた物性を兼ね備えている．これらの優れた特徴からBCは，人工血管や火傷被覆材などの医療用材料への用途展開が進められている．しかし BCを有効活用し，新規産業材料の開発をより一層進めるために生産性を改善することが望まれる．糖加水分解酵素CeSZはBCの生産性に関わることが知られており，CeSZの反応メカニズムを詳細に理解することは，合理的なBC生産プロセスの構築に寄与する．そこで本申請課題では，X線自由電子レーザーを用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析（SFX）の手法に基づき，CeSZの動的構造情報を取得することで，CeSZによる反応の分子メカニズムを解明することを目的とする．令和4年度は主に，クライオトラップ法により，野生型CeSZと基質や反応中間体との複合体構造を得ることを目指した．バッチ法により異なるpH条件で微小結晶を作成し，反応中間体の構造を捉えることに成功した．これは，変異体を利用していないという点で従来のCeSZ-基質複合体構造とは異なり，実際の基質の反応を反映した構造情報と言える．一方，CeSZの発現量は極めて高く，大腸菌培養液1Lあたり数百ミリグラムの精製標品を得ることが可能であることから，各種実験に用いるタンパク質生産コストを軽減することができた．そこで，当初計画していなかった糖質分解酵素L/Eの構造機能解析に着手し，X線結晶構造解析の手法により，アポ型，糖鎖結合型の構造を決定することに成功した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請時点では，令和4年度にX線自由電子レーザーを用いたSFX測定を実施するのみを計画していたが，研究を遅滞することなく進めるために，従来のX線結晶構造解析により中間体構造を取得することも並行して進めた．結果として，クライオトラップ法により，野生型酵素の微小結晶と基質を用いてX線回折データを取得し，中間体構造を決定するに至った．
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| 今後の研究の推進方策 |
令和4年度までにCeSZの生産からクライオトラップ法による反応中間体構造の決定までを実施した．最終年度である令和5年度は，SFX測定による非平衡状態における反応中間体の追跡が可能か検証するとともに，引き続きクライオトラップ法による反応中間体構造解析を進める．また，構造情報と生化学実験をもとにCeSZによる反応機構について考察し，成果を報告する．さらに，糖質分解酵素L/Eについての成果を学術論文に投稿する．
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