| 研究課題/領域番号 |
21K06085
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43030:機能生物化学関連
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
片根 真澄 北里大学, 薬学部, 准教授 (90383653)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
完了 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
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| キーワード | D-グルタミン酸シクラーゼ / D-グルタミン酸分解酵素 / D-グルタミン酸 / 5-オキソ-D-プロリン / 比色定量法 / D-アミノ酸 / 心臓 / 心不全 / D-ピログルタミン酸 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
哺乳類といった高等生物の体内において、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）を分解する酵素は長い間不明であった。我々は、その酵素（D-Glu シクラーゼ）のクローニングに哺乳類で初めて成功し、本酵素の触媒機構を明らかにしてきた。しかし、哺乳類といった脊椎動物の D-Glu シクラーゼには細菌や無脊椎動物のホモログにはない機能未知のドメイン・領域が存在しており、これがどのような役割を担っているのか明らかになっていない。そこで本研究では、D-Glu シクラーゼ活性の迅速で簡便な測定法を開発し、構造機能相関を明らかにすることで、D-Glu シクラーゼによる D-Glu の代謝機構の全貌解明を目指す。
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、遊離の D-グルタミン酸（D-Glu）の分解酵素として最近同定した、哺乳類 D-Glu シクラーゼ（DGLUCY；D-Glu を 5-オキソ-D-プロリンと水に分解する反応を可逆的に触媒する酵素）の代謝機構の全貌を解明することである。
2021 年度および 2022 年度には、DGLUCY 活性の測定法に関する研究を進め、吸光度計を用いた比色定量に基づく迅速で簡便な DGLUCY 活性の新規測定法を開発した。すなわち、5-オキソ-D-プロリンの 2-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩による誘導体化反応の最適な条件を決定した。また、比色定量法を用いてマウス組換え DGLUCY の D-Glu に対する動力学定数を決定し、本法を用いて DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることを明らかにした。さらに、野生型および DGLUCY ノックアウトマウスそれぞれから樹立した培養細胞株の抽出液を酵素源として DGLUCY 活性を測定し、比色定量法を用いて細胞可溶化液中における DGLUCY の酵素活性を正確に測定できることを明らかにした。
2023 年度には、C 末端に His タグが付加された、マウス DGLUCY の N 末側領域のみ、および C 末側領域のみを発現する大腸菌を用いて、DGLUCY の構造機能相関に関する研究を進めた。定法に従って大腸菌を培養し、超音波処理により菌体を破砕した。得られた crude extract に含まれる組換えタンパク質を、Ni カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。その結果、N 末側領域はほぼ単一の状態で精製される一方で、C 末側領域は様々な培養条件においても crude extract に回収されないことが明らかになった。今後、His タグの位置をN 末端に変更して同様の解析を進める予定である。
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