| 研究課題/領域番号 |
21K06119
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分43050:ゲノム生物学関連
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
井上 詞貴 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (60525369)
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| 研究分担者 |
BOURQUE GUILLAUME 京都大学, スーパーグローバルコース医学生命系ユニット, 招へい研究員 (80890566)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
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| キーワード | エンハンサー / 転移因子 / MPRA / ゲノム進化 / エピゲノム / iPS細胞 / 神経前駆細胞 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
転移因子はヒトゲノムの半分近くを占め、何ら機能を持たないJunk DNAと考えられてきた。近年のエピゲノム研究により、近傍遺伝子の転写を制御する「エンハンサー」機能を持ちうる事が示唆されているが、その詳細は不明である。本研究では、転移因子に生じた中立的変異がどのようにエンハンサー機能獲得に寄与し、進化的に保存・変遷してきたかについて、大規模並列レポーターアッセイ法(lentiMPRA)を用いて明らかにし、ゲノム機能獲得・変遷の側面から見たヒト進化を理解する。
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| 研究実績の概要 |
本研究では、転移因子機能の進化を明らかとするため、大規模並列レポーターアッセイ法（lentiMPRA）を用い、iPS細胞、神経前駆細胞における転移因子のエンハンサー活性を大規模並列的に解析する。
先行研究で行ったエピゲノム解析から、MER11、MER34、MER52が iPS細胞および神経前駆細胞においてエンハンサー活性を持つと予想されたため、これらの転移因子ファミリーのバリアント合計約17,000配列を含むMPRAライブラリを作製した。これをヒトiPS細胞および神経前駆細胞へ導入し、細胞から回収したDNAおよびRNAバーコードについてNextSeqによるシークエンシングを行った。バイオインフォマティクス解析パイプライン（MPRAflowおよびMPRAnalyze）を用い、DNAおよびRNAバーコードを定量した。3実験群で高度に再現性があること、ポジティブコントロール配列、ネガティブコントロール配列が予想通りの挙動であること、既知のエピジェネティック修飾と相関があることを確認した。MER11の多くがiPS細胞において特異的に高いエンハンサー活性を持つことを見出した。従って、MER11サブファミリーの詳細な系統樹を作成し、その分岐とエンハンサー活性の獲得・消失の関連を解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の予定通り、MPRAライブラリの作製・クオリティチェック、MPRA実験条件最適化、DNA/RNAバーコードシークエンシング、バイオインフォマティクス解析を終了している。
期待通り、iPS細胞において高いエンハンサー活性を呈する転移因子を同定することに成功している。再現性や、コントロール配列が期待通り挙動することも確認している。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きMPRAの詳細なデータ解析を行う。特に、MER11サブファミリーのエンハンサー活性を担う配列・塩基、転写因子結合モチーフを明らかとする。エンハンサー活性の変化に関連する重要な塩基置換を系統的に理解する。これにより、MER11の機能の進化的変遷とその分子機構を明らかとする。また、ヒト、チンパンジー、カニクイザルのMER11配列比較を行うことで、種分岐後の変異獲得と機能の関連を検討する予定である。また、得られた結果を多角的に検証するため、ルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、CRISPRiによる機能解析を行う予定である。
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