| 研究課題/領域番号 |
21K06157
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分44010:細胞生物学関連
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| 研究機関 | 東京理科大学 |
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研究代表者 |
長野 真 東京理科大学, 先進工学部生命システム工学科, 特別講師 (50572715)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 2,080千円 (直接経費: 1,600千円、間接経費: 480千円)
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| キーワード | エンドソーム / トランスゴルジネットワーク / 出芽酵母 / メンブレントラフィック / Rab5 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
細胞内では恒常的に、膜小胞の融合によって形成されたエンドソーム(ES)がリソソームに融合して消失しているため、この形成機構の解明は、ESが関わる細胞機能の解明や疾患の理解、治療法の確立に重要と考えられてきた。申請者は近年出芽酵母において、新規なES形成機構を見出した。トランスゴルジネットワーク(TGN)で形成された膜小胞上で、低分子量GTPase Rab5が活性化されてESが形成されることを明らかにした。本申請課題では、これらの先行研究の成果をもとに、この新規なES形成の分子機構の解析を進め、ESが関わる生理現象や疾患メカニズムの理解につながる新しい学術的基盤を構築する。
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| 研究実績の概要 |
今年度は、(1) Rab5特異的なGFEFであるVps9pの結合因子の探索、(2) Pik1p/Rab11/GGAsによるRab5活性化のメカニズム、および(3) Arf1pと独立してRab5の活性化を制御する因子の探索を進めた。
(1)では、GST-Vps9pをbaitとして、出芽酵母のタンパク質抽出液からVps9p結合因子の単離を試みた。まず、大腸菌リコンビナントでGST-Vps9pを発現・精製する実験系を導入し、完了した。続いて、得られたGST-Vps9p用いて、プルダウン法で結合タンパク質の精製を行った。現在のところ、コントロールとしておいたGSTのプルダウンフラクションと比較して、SDS-PAGE上、GST-Vps9pで特異的なバンドは得られていない。次年度は、精製法の改善を図る。
(2)では、3つの因子について、単独あるいは複数組み合わせで、機能欠損株を作製し、Rab5ホモログVps21pの活性化レベルを解析した。この結果、Pik1p単独の機能欠損株では、野生株と比較して80%以上の活性化レベルであり、単独では大きな影響を与えないことを明らかとした。次に。複数組み合わせて機能欠損株を解析したところ、Pik1/Rab11の機能欠損株で60%程度、Pik1/Rab11/GGAsの機能欠損株で10%まで低下することを見出した。これら以外の組み合わせでも同様に検討し、Pik1、Rab11、GGAsがそれぞれ独立してRab5活性化に関与することが明らかとなった。これらの研究結果を含め、学術論文に投稿し、現在査読中である。
(3)では、ゴルジ/TGNに局在するタンパク質の中で、その遺伝子欠損によって、エンドソーム輸送前後のステップでエンドーリソソーム輸送が異常となるものに注目し、ARF1との二重欠損株を作製し、GFP-Vps21pのエンドソーム輸送への影響を解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要に示した(2)の研究結果を学術論文に投稿し、数度の査読を経て、改訂が進んだ。現在まだアクセプトには至っていないが、最終段階に来ている。また、この成果はすでにプレプリントで公開済みである。
(1)と(3)についても、順調に準備が進んでいる。
以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初計画に沿って進める。
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