転写伸長過程における幹細胞らしさの制御の生化学的解析

研究課題

研究課題/領域番号	21K06213
研究種目	基盤研究(C)
配分区分	基金
応募区分	一般
審査区分	小区分44030:植物分子および生理科学関連
研究機関	京都大学
研究代表者	槻木竜二京都大学, 理学研究科, 助教 (50303805)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
研究課題ステータス	交付 (2022年度)
配分額 *注記	4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円) 2023年度: 650千円 (直接経費: 500千円、間接経費: 150千円) 2022年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円) 2021年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
キーワード	植物幹細胞
研究開始時の研究の概要	幹細胞らしさは独自の遺伝子発現プログラムにより成立すると考えられる。真核生物では、転写開始後の転写の段階が遺伝子発現に特に重要であることがわかりつつある。植物幹細胞の分化は、転写開始後の段階で制御されているのか？そうであれば、どの遺伝子がどのように制御されているのか？本研究では、幹細胞において転写進行中のRNAポリメラーゼ IIと転写共役因子を生化学的に解析して、幹細胞らしさに関わる遺伝子発現制御機構の解明を目指す。
研究実績の概要	植物では、器官形成が一生続けられる。器官形成に必要な幹細胞が一生を通じてアクティブということである。幹細胞らしさの分子実体は何か？それはどのように確立し、維持されるのか？幹細胞から生じた娘細胞は、分化の際に幹細胞らしさをどのように失うのか？幹細胞らしさは独自の遺伝子発現プログラムにより成立すると考えられる。真核生物では、転写開始後の段階が遺伝子発現に特に重要であることがわかりつつある。植物幹細胞の分化は、転写開始後の段階で制御されているのか？そうであれば、どの遺伝子がどのように制御されているのか？シロイヌナズナにおいて、幹細胞らしさを負に制御するVAH遺伝子を見出している。vah機能欠損変異体では、幹細胞領域の拡大や異所的な形成が見られる。VAHは、CLV3とは別の経路で働き、茎頂の幹細胞らしさを正に制御するWUSCHEL（WUS）などの発現を負に制御する。１）VAHタンパク質が他のタンパク質と複合体を形成し、機能していることを明らかにした。２）vah変異体では、RNAポリメラーゼ IIの転写伸長動態に異常があることを見出した。３）RNAポリメラーゼ IIと相互作用する転写共役因子の同定方法を確立した。転写共役因子として、RNAのプロセッシングに関わるもの、転写伸長に関わるもの、ヒストン修飾に関わるもの、ヒストンシャペロンなどを同定した。vah変異体では、RNAポリメラーゼ IIとヒストンシャペロンの相互作用に異常があることを見出した。また、同ヒストンシャペロンの特異抗体の作製に成功した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由現在までに、VAHと共に働くタンパク質因子の同定に成功している。VAHとこれら因子は、植物幹細胞制御の観点からはほとんど解析されていない。また、VAHがRNAポリメラーゼIIの転写伸長過程の制御に関わることを示唆する結果を得ている。本研究を進めることにより、転写伸長過程における植物幹細胞分化制御についての新規な知見が得られると期待される。
今後の研究の推進方策	これまでの研究から、VAHと共に働くタンパク質因子を複数同定し、VAHがRNAポリメラーゼIIの転写伸長過程の調節に関わることが示唆されている。これらを踏まえ、以下の解析を進める。１）VAHを介した転写伸長制御機構を明らかにするために、改良した抽出方法を用いて、VAHと共に働く因子の網羅的同定を進める。VAHを指標に免疫沈降を行い、質量分析によりVAHと相互作用する因子を分子同定する。２）転写伸長中のRNAポリメラーゼIIの免疫沈降を行い、転写中のRNAポリメラーゼIIと相互作用する転写共役因子を網羅的に分子同定する。vah変異体と野生型を比較解析する。３）vah変異体で、RNAポリメラーゼIIとの相互作用が異常なヒストンシャペロンを同定している。同タンパク質に対する特異抗体の作製にも成功しており、これを用いて、タンパク質複合体の免疫沈降を行う。vah変異体と野生型を比較解析する。４）vah変異体と野生型で、転写伸長中のRNAポリメラーゼIIのクロマチン免疫沈降を行い、ゲノムワイドでRNAポリメラーゼII、同ヒストンシャペロンのゲノムへの結合状態を比較解析する。