| 研究課題/領域番号 |
21K06377
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46010:神経科学一般関連
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
山崎 世和 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (60581402)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,950千円 (直接経費: 1,500千円、間接経費: 450千円)
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| キーワード | 抑制性シナプス / アデノ随伴ウイルス / シナプス伝達 / シナプス分子 / シナプス分子構成 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
抑制性シナプス伝達は、活動電位の発生パターンやタイミング、同時発火を制御することによって正常な脳機能発現のために必須の役割を果たす。抑制性シナプス後部にはGABAA受容体に加え、副サブユニットを含む多数の関連分子が集積しており、シナプス機能の発現に重要な役割を担う。一方、脳には多くの種類の抑制性神経細胞が存在するが、それぞれのシナプスに集積する分子の構成は明らかになっていない。本研究では、抑制性のシナプス後部に集積する分子に着目し、どの分子がどのシナプスに局在しているのかを体系的・網羅的に明らかにするとともに、特定のシナプスに特異的に局在する分子マーカーの同定を目指す。
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| 研究実績の概要 |
脳には様々な種類の抑制性神経細胞が存在し、種類の抑制性シナプスを形成しているが、どの種類のシナプスにどのような分子が集積しているのかよくわかっていない。本研究では抑制性シナプスにおいて、特にそのシナプス後部にどのような分子が存在しているのかを明らかにし、さらにそれらの分子を人為的に操作することによって、任意の抑制性シナプスを選択して操作する技術を開発することを目的としている。
本研究では、近接依存性ラベル化酵素TurboIDを抑制性シナプス後部に局在させ周辺タンパク質をビオチン化しそれらを同定する。TurboIDのシナプス局在には、ALFAタグ-膜貫通領域-TurboID融合タンパク質（Labeling module）を錐体細胞に、抗ALFAナノボディ-GPIアンカー融合タンパク質（Targeting module）を抑制性神経細胞に発現させることで行う。これら二つのタンパク質はTranssynapticに相互作用し、抑制性神経細胞と錐体細胞の接合部、すなわちシナプスに集積することが期待される。
これまで、Labeling moduleとTargeting moduleを設計、AAVベクターに組み込み、マウスの脳で発現することを確認していた。一方で、次のステップであるプロテオーム解析を行うため、より広範な脳領域により強く発現させることが必要であった。よって本年度はこの点を検討した。広範な発現領域を確保するために、AAVの血液脳関門透過型の血清型であるPHP.eBを使用することにしたが、作成時の細胞密度・Plasmid導入量を最適化することでより高いタイターのAAVを安定して確保することが出来るようになった。また、CMVのmini promoterやCre依存的CAGプロモーター、Tet-off systemを組み込み、目的細胞に高いレベルでタンパク質が発現することが確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本来の計画では、最終年度である本年度には、抑制性シナプス後部を特異的に標識するLabeling moduleとTrageting moduleの発現系を確立し、プロテオーム解析によって分子組成を解析、それぞれの抑制性シナプスのマーカー分子を同定、それらを用いて任意の種類の抑制性シナプス操作Moduleを作成している予定であった。しかしながら、これまでLabeling module、Targeting moduleの発現には成功していたものの、その発現領域、発現量が十分でなく、これを改善するための検討に時間を予定以上に費やしてしまったため、当初の予定よりも遅れることとなった。しかしながら、本年度において、AAV産生系の再検討とプロモーター等の検討を行ってきて、ポジティブな結果を得ることが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の予定より遅れてしまったが、今後は本年度に行った実験結果を元に新しくAAVベクターを作成、得られたAAVによってLabeling module、Targeting moduleがそれぞれ錐体細胞、抑制性神経細胞に高いレベルで発現することを確認する。そしてこれらを発現し抑制性シナプス後部分子をビオチン化ラベルした脳からタンパク質を精製、シナプス後部の分子構成を明らかにする。この実験を、錐体細胞が作る様々な抑制性シナプスにおいて行い、その結果を比較、それぞれのシナプスに特徴的な発現分子を同定し、これらとシナプス操作分子の融合タンパク質を作成することで、特定の抑制性シナプス操作技術の確立を目指す。
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