| 研究課題/領域番号 |
21K06394
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46010:神経科学一般関連
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
高山 千利 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60197217)
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| 研究分担者 |
清水 千草 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (70435072)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,820千円 (直接経費: 1,400千円、間接経費: 420千円)
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| キーワード | GABA / グリシン / 神経損傷 / 神経再生 / KCC2 / ミクログリア / 脛骨神経 / 電子顕微鏡 / γアミノ酪酸（GABA） / K+, Cl- 共輸送体2（KCC2) / 末梢神経再生 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
１．神経損傷後、GABA/グリシンの興奮性応答を介して再生が促進する分子メカニズム(カスケード)を明らかにする。GABA/グリシンの興奮性/抑制性を決定するカギとなる分子がKCC2である。そのKCC2の活性を調節するメカニズムと、KCC2の変化によって変化する分子を明らかにすることで、カスケードの全容を解明する予定である。
２．１で開発されたカスケードを元にして、神経再生を促進する方法を探索する。動物への介入実験を行い、このカスケードを活用した再生治療の開発を行う予定である。
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| 研究実績の概要 |
GABAとグリシンは、成熟動物の主要な抑制性神経伝達物質である。両者は幼若期に興奮性応答を示す事から、形態形成に関与すると考えられてきた（Kobayashi et al. 2021, Shimizu et al. 2022）が、ノックアウトマウスの解析から、現在は否定的である。我々は、神経損傷後の運動神経軸索の再生期にもGABA/グリシンが興奮性応答を示すことを見出し（Tatetsu et al. 2012, Kim et al. 2018）、興奮性応答が損傷軸索の再生を加速するという仮説をたてて研究を行っている。
①新しいタイプの神経損傷モデルとして、脛骨神経結紮動物を用い、損傷後の変化を解析した。その結果、（１）ミクログリアの活性化⇒KCC2発現の減少⇒軸索再生のシグナル経路が認められ、神経損傷後に共通する現象であることが示された。（２）ガラニン、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）2つの分子の動きが神経軸索の変性と再生を示す客観的指標となることが明らかになった。この研究は、Neuroscience Research誌に掲載された（Yafuso et al. 2022）。
②GABA/グリシンを抑制性に導く輸送体(KCC2)を半減させたKCC2ノックアウトマウスのヘテロ接合体と野生型を比較して、運動神経切断・縫合後の運動機能の変化などを解析した。その結果、KCC2が半減し、GABA/グリシンの応答性が興奮性にシフトしたマウスにおいて、（１）運動機能の障害程度が低く回復が早い。（２）神経軸索の再生が早く進行する。（３）有髄線維の密度、神経軸索の変性・再生を示すマーカーの変化が（２）を裏付けている。以上、３つの傾向が認められた。
③野生型マウスとKCC2ノックアウトヘテロ接合体について神経損傷後脊髄におけるmRNA解析を行って、大きく変化する分子について解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
①種類の異なる神経損傷マウスの解析において切断モデルと同様の結果をえられた。我々の仮説が１つ裏付けられ、投稿した論文が受理され、雑誌に掲載された。
②KCC2ヘテロマウスの研究においては、順調に進んでおり、行動解析、組織学的解析、マーカー発現解析はほぼ終了した。現在、再生軸索の伸展について動物数を増やして検討を加えている。
③ｍRNAの発現変化の解析において、思わしい結果が得られなかったため、もう一度行っている。今後１年間かけて、下流にある分子の特定を行う予定で進めている。
④治療に向けた取り組みは、今後①～③の結果を見て実施する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
①KCC2ノックアウトヘテロ接合体の解析を継続し、KCC2発現量の減少、GABA/グリシンの応答性の変化が運動機能の回復、神経線維の再生を有意に促進しているか解析を続ける。
（１）十分な動物数で実験を行い、各手術後日齢で10例ずつを揃える予定である。
（２）新しい蛍光顕微鏡を用いて、再生軸索をWhole mountで観察し、早期の神経の再生過程、有髄線維の変化に有意差があるか否かを確定させる。
（２）神経軸索の変性・再生過程がヘテロと野生型でどのように異なるかを詳細に解析する。
以上の結果をまとめて論文として投稿し、学会発表を行う予定である。
②KCC2減少の下流にある分子を特定し、実際にモデルマウスにおいて変化しているかを確定し、そのメカニズムを明らかにする。
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