| 研究課題/領域番号 |
21K06412
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46020:神経形態学関連
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
田中 雅樹 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (80264753)
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| 研究分担者 |
渡邊 義久 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (50363990)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | オートファジー / 神経細胞 / GFP-LC3-RFP / トランスジェニックマウス / NPY / GFP-LC3 / 脳組織 / ストレス |
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| 研究開始時の研究の概要 |
オートファジーが神経系機能に関与することが示唆されているが、詳細は不明である。本研究は、我々が作製したオートファジー活性化可視化トランスジェニックマウス(SYN1-GFP-LC3-RFPマウス)が、神経細胞特異的にどの程度オートファジーの活性化をモニターできるのかを補助事業期間中に脳内各部位で詳細に検討・評価し、実際にモデル動物を作製してストレス・情動系への関与を、オートファジー活性状況を組織学的に解析して明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
研究室で作製した神経特異的なオートファジー活性可視化マウスの解析に取り組んでいるが、繁殖の過程でなかなかホモ接合体のマウスが生まれず、苦労している。
神経特異的なsyn1プロモーター下にニューロンに発現する、SYN1-GFP-LC3-RFPトランスジェニックマウスの脳組織発現について脳全体について調べた。嗅球、線条体、海馬、橋核などにGFPを発現する細胞が出現した。大脳皮質や海馬でNeuNとの共存が見られるが、GFAPとの共存は見られず、これら発現細胞はニューロンであることが確かめられた。特に嗅球や海馬、線条体には軸索や樹状突起のような突起にGFPが出現し、RFPは主に細胞体に見られた。RFPは大脳皮質や海馬に発現があり、領域によって、ベースのオートファジー活性が異なることが示唆された。トランスジェニックマウスの初代培養細胞を用いた薬剤投与実験で、オートファジーを抑制するバフィロマイシンA1を投与するとGFP-LC3の凝集がみられ、オーファジーレセプターであるP62の凝集と共存が見られた。オートファジー活性化が進むと、GFPとRFPの比が低下することになるが、実際オートファジー誘導剤である、リチウムを飲水に混ぜて1か月投与させると、海馬錐体細胞の細胞体、樹状突起でGFP/RFPが低下した。今年度培養細胞や動物脳局所のオートファジー活性を上げたり、阻害させたりして詳細な検討を行う研究とATG5 floxマウスを用いた解析：SYN1-GFP-LC3-RFPマウスとATG5 floxマウスを交配してホモマウスを作製し、脳局所AAV-Creを感染させることにより、コンディショナルにATG5を脳局所でノックアウトしてオートファジーを止める研究を計画している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
SYN1-GFP-LC3-RFPトランスジェニックマウスの繁殖は生まれた、新生仔を母マウスが喰殺してしまい、思った以上に時間がかかることが判明した。そのためケージの中に育児ハウスを設けたり、バイトチップを与えたりして、ストレスを軽減させることで、ようやく仔マウスが増えたが、なぜか遺伝子検査では、ホモが出生していない。
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| 今後の研究の推進方策 |
ホモマウスの出現を待って以下のプロジェクトを進める予定である。
１．初代培養細胞を用いた検索：2024年度はマウス海馬初代培養細胞を用いた解析を行って、オートファジーを止めたり、促進させたりすることによる、GFP-LC3やRFPの細胞内動態を組織細胞化学的に詳細に検討するとともにLC3抗体や抗GFP抗体を用いてウエスタンブロッティングによりオートファジーfluxを調べ、生化学的にもオートファジーを表現しているかどうかを確認する。
２．ATG5 floxマウスを用いた解析：SYN1-GFP-LC3-RFPマウスとATG5 floxマウスを交配してホモマウスを作製する。マイクロシリンジにて、脳局所AAV-Creを感染させることにより、コンディショナルにATG5を脳局所でノックアウトしてオートファジーを止める。
３．これまでのデータをまとめて、学会等で発表し、論文作成の準備を行う。
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