| 研究課題/領域番号 |
21K06428
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分46030:神経機能学関連
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
船橋 靖広 藤田医科大学, 医科学研究センター, 講師 (00749913)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 1,560千円 (直接経費: 1,200千円、間接経費: 360千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 学習・記憶 / シナプス可塑性 / 長期増強 / スパイン / Rho-kinase / グルタミン酸 / NMDA / 忌避行動 / CaMKII / 樹状突起スパイン / カルシウム / リン酸化 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
中枢神経系の主要な神経伝達物質であるグルタミン酸はNMDA受容体を介してCaMKIIやRho-Kinase/ROCKなどのリン酸化酵素を活性化し、様々な標的蛋白質をリン酸化することで、シナプス可塑性を制御し情動・認知機能に関与すると考えられているが、その分子制御機構については依然として不明な点が多い。本研究では、シナプス可塑性に関与するRho-Kinaseの基質を特定しその作用機構を明らかにすると共に、忌避行動、学習・記憶におけるグルタミン酸ーCaMKIIーRhoAーRho-Kinase経路の役割を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
前年度までに、忌避刺激（マウス足裏への電気刺激）により線条体/側坐核領域にて、NMDA受容体/CaMKⅡ/RhoA/Rho-kinase経路が活性化すること、側坐核のドーパミンD2受容体を発現する中型有棘神経細胞（D2R-MSN）にてRho-kinaseを欠損させると忌避学習・記憶が低下することを見出した。忌避学習・記憶の形成には、側坐核のD2R-MSNのシナプスの長期増強（long-term potentiation；LTP）が関与することが考えられるため、本年度は、Rho-kinaseが側坐核のD2R-MSNのLTPに関与するかどうかを電気生理学的に解析した。急性脳スライスを作製し、ホールセルパッチクランプ法によって側坐核D2R-MSNの興奮性シナプス後電位を記録した。スパイクタイミング依存性シナプス可塑性（spike-timing-dependent plasticity；STDP）プロトコールによって可塑性を誘導したところ、D2R-MSNのシナプスでLTPが誘導された。一方、Rho-kinase阻害剤で（Y-27632）でスライスを処理すると、後期段階（STDP誘導後25-30分）でのLTPが有意に減弱した。LTPの初期段階（STDP誘導後0-5分）に対しては有意な差は認められなかった。したがって、LTPの維持にRho-kinaseが関与する可能性が示唆された。次に、Rho-kinaseがスパイン形態を制御するかどうかを検証するために、Rho-kinaseのコンディショナルノックアウトマウスを用いて、スパインの形態に対するRho-kinase欠損の影響を検討した。側坐核のD2R-MSNにて、Rock1とRock2の両方を欠損させると、スパイン密度が減少することが明らかになり、Rho-kinaseが樹状突起スパインの形態可塑性を制御していることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2023年度は当初予定していた以下の2つの項目について解析を行った。
1.シナプス可塑性の電気生理学的解析
Rho-kinaseが側坐核のD2R-MSNのLTPに関与しているかどうかを検討するために、急性脳スライスを作製し、ホールセルパッチクランプ法によって側坐核D2R-MSNの興奮性シナプス後電位を記録した。スパイクタイミング依存性シナプス可塑性（STDP）プロトコールによって可塑性を誘導したところ、D2R-MSNのシナプスでLTPが誘導された。一方、Rho-kinase阻害剤で（Y-27632）でスライスを処理すると、後期段階（STDP誘導後25-30分）でのLTPが有意に減弱した。LTPの初期段階（STDP誘導後0-5分）に対しては有意な差は認められなかった。したがって、LTPの維持にRho-kinaseが関与する可能性が示唆された。
2. スパイン形態可塑性の解析
Rho-kinaseがスパイン形態を制御するかどうかを検証するために、Rho-kinaseのコンディショナルノックアウトマウスを用いて、スパインの形態に対するRho-kinase欠損の影響を検討した。側坐核のD2R-MSNにて、Rock1とRock2の両方を欠損させると、スパイン密度が減少することが明らかになり、Rho-kinaseが樹状突起スパインの形態可塑性を制御していることが示唆された。
以上のことより、本年度研究開始時に立てた実施計画と目標はほぼ達成出来たと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
2024年度は、以下の2つの項目について、解析を行う予定である。
１.忌避刺激によるリン酸化シグナルの免疫組織学的解析
2023年度までに生化学的解析にて、忌避刺激後に線条体/側坐核領域にて、ARHGEF2（CaMKⅡ基質）やMYPYT1（Rho-Kinase基質）のリン酸化が亢進することを明らかにした。2024年度はD2R-MSN特異的にYFPを発現するトランスジェニックマウスを用い、これらのリン酸化がD2R-MSN特異的かどうかを免疫組織学的解析により検討する。
２.スパインの形態可塑性の解析
Rho-kinaseのドミナントネガティブ変異体やSHANK3のリン酸化部位変異体を発現するAAVを側坐核のD2R-MSNに発現させ、樹状突起スパインの形態解析を行う。また、さらに、LTPを誘導しスパイン増大を引き起こした際のRho-kinaseのドミナントネガティブ変異体やSHANK3のリン酸化部位変異体の効果を検討する。
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