| 研究課題/領域番号 |
21K06517
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47020:薬系分析および物理化学関連
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| 研究機関 | 国際医療福祉大学 |
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研究代表者 |
阿部 義人 国際医療福祉大学, 福岡薬学部, 教授 (60315091)
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| 研究分担者 |
山下 智大 九州大学, 薬学研究院, 講師 (30645635)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,170千円 (直接経費: 900千円、間接経費: 270千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,690千円 (直接経費: 1,300千円、間接経費: 390千円)
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| キーワード | 抗P2X4抗体 / タンパク質工学 / タンパク質化学 / 大腸菌発現 / 抗体工学 / 大腸菌発現系 / Fab / P2X4受容体 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
低分子化抗体Fabは安定性、抗原親和性が優れており、抗体医薬品の次世代フォーマットとして期待されている。Fabは大腸菌発現から得られたリコンビナントが医薬品にも使われているが、リコンビナントFabは各抗体依存的に発現量が少ないものも多い。そこで我々は大腸菌発現系で調製した可溶性抗P2X4抗体Fabのアミノ酸変異を行い、大腸菌発現量の理論的な改良を目指す。さらに調製したFab を利用し、痛みのターゲット分子であるP2X4受容体の機能抑制を目標とした酵素とのコンジュゲート抗体の調製および評価を行う。また抗体医薬品において問題となっている凝集抑制を目的とした糖鎖付加法の開発を行う。
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| 研究実績の概要 |
本研究計画では、痛み受容体であるP2X4に対する抗体Fabの大腸菌発現量上昇に関するデータ収集およびリコンビナントFabを用いた応用研究であるP2X4機能抑制 抗体の創製を目的とした。以前、我々は大腸菌から時間や手間暇のかかる巻き戻し系を使わずに、可溶性Fabを調製できる方法を確立し、さらに一アミノ酸変異 を加えることにより、可溶性Fabの回収量を6~7倍増やした発現系を構築した。昨年度は、さらに他の一アミノ酸変異を加えることで、発現量が増加する変異体の検出を試み、その過程で増減を簡便に検出できる方法として、抗Fab抗体を用いたウェスタンブロッティングの改良法を開発した。さらに種々のアミノ酸変異 を加えたことによる発現量の検討を行い、現在得られている回収量を上回る変異体は得られていないが、今後迅速に変異体の発現量を検討することができるようになった。本結果は第12回国際医療福祉大学学会学術大会にて発表し、本年度日本蛋白質科学会にて発表する予定である。本年度は各変異体の物理学的性質を分光法、結晶解析で検討するためにFabの精製を進めた。得られた精製Fabに関しては結晶化スクリーニングにより検討を行い、現在、薄い平板結晶ではあるが、変異体において結晶を得た。今後SPring8ビームライン等で、構造解析を行う。ATP加水分解酵素と架橋試薬でつないだFabに関しては、P2X4発現細胞を用いたカルシウムイオン流入実験のプレ実験を行ったが、現時点でP2X4のカルシウム流入阻害に関して、ポジティブな結果は得られていない。しかしながら、今後架橋基等を変更して検討を行う。また糖鎖の導入に関しても架橋基導入で得られた知見を用いて、今後進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は大腸菌発現可溶性Fabの各種変異体を精製し、大量調製・精製を一週間程度で行えるようになってきた。これらの精製Fabを用いて結晶化条件の検討をおこなった。条件検討の結果、X線結晶構造解析に向けた結晶を得ることができるようになった。一方でATP加水分解酵素と架橋試薬でつないだFabに関しては、P2X4発現細胞を用いたカルシウムイオン流入実験のプレ実験を行ったが、現時点でP2X4のカルシウム流入阻害に関して、ポジティブな結果は得られていない。糖鎖修飾も含め今後の検討が必要である。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌発現可溶性Fabの各種変異体の精製・調製法が一週間程度で行えるようになってきたため、分子界面に変異をもつ変異体を順次、精製結晶化をおこなっていく。物理的性質は本大学へのCDの導入時期が大幅に遅れているため、他大学での貸与も検討している。また、ゲル濾過を使った凝集状態の検出なども含め、本研究計画の一つのテーマである分子界面の影響について、詳細に進めていく。また、化学修飾による架橋に関しても、架橋するFabの調製は上記の方法を利用し、終了している。新規の架橋試薬も購入しており、それらを用いて架橋・修飾条件の検討を行う。
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