| 研究課題/領域番号 |
21K06530
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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| 研究機関 | 東北医科薬科大学 |
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研究代表者 |
狩野 裕考 東北医科薬科大学, 薬学部, 助教 (40774279)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2021年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
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| キーワード | ガングリオシド / スフィンゴ糖脂質 / パイロトーシス / 自然免疫応答 / 炎症 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
慢性炎症は、Toll様受容体4（TLR4）などの自然免疫受容体の活性化によって引き起こされ、メタボリックシンドロームを含む多様な疾患の発症に関与する。これまでに申請者は、①血清中や脂肪組織のスフィンゴ糖脂質：ガングリオシドGM3がTLR4に作用することで慢性炎症を引き起こすこと、②その作用はGM3に含まれる脂肪酸（アシル鎖）の化学構造（鎖長や不飽和度）の違いによって調節を受けることを見出している。本研究課題では、異なるアシル鎖構造を持つGM3が体内で産生されるメカニズム、さらにTLR4を活性化して慢性炎症へと導くメカニズムを、分子レベルで明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
今年度は、以下の研究成果を得ることができた。
(1) 組み換え全長Casp4/11発現系の構築：これまでに、マクロファージ細胞に対するLPSおよび各種脂肪酸構造のガングリオシドGM3の共刺激によって、炎症性サイトカインIL-1aの産生量が大幅に増大または抑制されることを見出している。IL-1aは非古典的インフラマソームを介したパイロトーシスによって放出されることから、その構成因子であるCasp4/11（細胞内LPS受容体）が、各種脂肪酸構造のGM3分子種によって直接的に活性化制御を受ける可能性が考えられる。そこで、大腸菌発現系を用い、Casp4/11のHis-tag融合タンパク質発現系を構築した。リガンド認識後の自己切断活性を低減したCasp4(C258A)およびCasp11(C254A)変異体として発現させることで、リガンド結合によって誘導される多量体形成を観察可能なコンストラクトとした。宿主は、LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系を用いることで、発現宿主内における意図しない多量体形成および活性化を低減できるよう考慮した。
(2) 組み換え全長Casp4/11精製系および多量体アッセイ系の確立：
LPS合成経路欠損型の大腸菌発現系であっても、LPS生合成中間体であるLipid-IVaは産生されることから、Affinity精製中に既報に基づいた界面活性剤による内因性代謝物洗浄ステップと、さらに界面活性剤自体の除去ステップを組み込むことで、より高純度の精製を可能にした。Affinity精製およびゲル濾過担体によるバッファー交換後のCaspase-4/11はSDS-PAGEにおいてほぼ単一バンドであり、ケミカルクロスリンクによる多量体検出アッセイにおいも単量体として得られていることが確認できた。これを用いることで、各種のスフィンゴ糖脂質分子種による多量体形成アッセイを確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本課題における組み換えタンパク質発現系は、可能であれば哺乳類細胞発現系または昆虫細胞発現系が望ましいが、種々の工夫によって大腸菌発現系で早期に達成できたことは、時間、費用、扱いの容易さにおいて大変有益と思われる。変異体タンパク質を用いた機能解析も容易となるため、今後の展開が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
組み換えタンパク質を用いた、各種のガングリオシド・スフィンゴ糖脂質分子種との相互作用解析や、多量体形成アッセイを進めることで、Casp4/11の活性化メカニズムと、脂肪酸および糖鎖構造に応じた構造特異性を明らかにする。得られた結果について、再度、ヒト細胞株やマウス個体での検証を試みる。
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