| 研究課題/領域番号 |
21K06571
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47030:薬系衛生および生物化学関連
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
齊藤 恭子 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (70235034)
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| 研究分担者 |
山地 俊之 国立感染症研究所, 細胞化学部, 室長 (50332309)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,030千円 (直接経費: 3,100千円、間接経費: 930千円)
2024年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2023年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2022年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2021年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
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| キーワード | 黄熱ウイルス / レプリコン / 複製 / 宿主因子 / ゲノムワイドスクリーニング / ワクチン産生細胞 / スクリーニング / 細胞改変 |
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| 研究開始時の研究の概要 |
黄熱ウイルス（YFV）が引き起こす黄熱病は、特効薬がなく、YFV弱毒株17Dを用いた生ワクチンによる予防が唯一の対策である。我々はYFV17DのRNA複製能をレポーター活性で評価できるサブゲノミックレプリコンを構築した。本研究では、当該レプリコンを用いたゲノムワイドスクリーニングによって、YFVの複製に関わる宿主因子を見出し、YFV17D高生産性細胞を作出する。また、当該細胞を用いて、YFVのゲノム複製機構の手がかりも得る。YFV17Dは、他種ウイルスに対するキメラワクチンの骨格として利用されることから、本研究は黄熱のみならず、広範なウイルスワクチンの生産性向上に資することが期待される。
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| 研究実績の概要 |
代表者はこれまでに、黄熱ウイルス（YFV）17D株のRNA複製能をレポーター活性（GFPとゼオシン耐性遺伝子の融合遺伝子）で評価できるサブゲノミックレプリコンを構築している。本研究では、当該レプリコンを用いて、①YFVの複製に関与する宿主因子を見出すことにより、YFV17D高生産性Vero細胞を作出すること、②YFVのゲノム複製機構の手がかりも得ることを目的としている。
これまでにYFV17Dのサブゲノミックレプリコンが持続的に複製されるVero細胞（レプリコン細胞）を樹立し、昨年度に論文として報告した。今年度は分担者の協力のもと、レンチウイルスベースのCRISPR/Cas9 single guide RNA（sgRNA）機能欠損型ライブラリを用いてスクリーニングを実行するための詳細な条件決定を実施した。レプリコン細胞にCas9を安定発現させた株を複数種分離し、それぞれについて、ゼオシンを除いて培養した時およびレンチウイルスを感染させた時のレポーター発現への影響を調べ、それが安定している株を選別した。また、ノックアウトが保証されている既知遺伝子のguide RNAを利用して、ゲノム編集が起こる株を選定した。現在、ゲノム編集効率等を確認しており、その後にスクリーニングの親株を決定する。またこれらの解析に並行して、YFV17D感染細胞内の構造変化をアポダイズド位相差顕微鏡、共焦点蛍光顕微鏡および超解像顕微鏡で観察することも行った。その結果、感染の時系列に沿って細胞骨格系の特徴的な変化を見出しており、今後は細胞骨格に関与する宿主因子の複製における機能にも注目していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、スクリーニングの親株として分離した細胞の中にレポーター発現が自然に低下したものがあったなど、想定外の結果が得られたため、条件検討に時間を要した。また、今年度は業務が大変多く、本研究に充てる時間がやや減少した。当初の計画に比較すると少々遅れているが、令和6年度に精力的に計画を進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
YFV17D の複製能を亢進または低下させる宿主因子を実際に探索する。スクリーニングがうまく機能しない場合は、レプリコン細胞のRNAseq解析等を実施し、発現が増減する宿主因子に着目し、複製能を高める因子の候補を探す。YFV感染細胞における細胞骨格変化に関与する宿主因子について生化学的な解析を進める。
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