| 研究課題/領域番号 |
21K06595
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分47040:薬理学関連
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
金子 雅幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (10322827)
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| 研究分担者 |
高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2022年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
2022年度: 1,300千円 (直接経費: 1,000千円、間接経費: 300千円)
2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
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| キーワード | ユビキチンリガーゼ / RNF183 / 近位ビオチン標識法 / ノックインマウス / NKCC1 / BioID / 高浸透圧 / ユビキチン / リソソーム / 浸透圧 / ゲノム編集 / 炎症性腸疾患 / ビオチンリガーゼ |
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| 研究開始時の研究の概要 |
腎臓の集合管に発現するユビキチンリガーゼ（ユビキチンをタンパク質に付加する酵素）RNF183は高浸透圧環境下で発現誘導されるが、高浸透圧環境下における生理的な機能についてはまだ解明できていない。そこで本研究では、ゲノム編集技術を駆使して、ビオチンリガーゼ（ビオチンをタンパク質に付加する酵素）をRNF183遺伝子に挿入することで、ビオチン化されたタンパク質をRNF183のユビキチン化基質タンパク質として生理的条件下で同定する。さらに、RNF183が関与する炎症性腸疾患と浸透圧ストレスの関連性を明らかにする。
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| 研究実績の概要 |
RNF183遺伝子にビオチンリガーゼBioID2とFLAGタグをゲノム編集によってノックインしたマウスを作出した。ノックインしたマウスからRNF183を発現する細胞を単離するため、蛍光タンパク質tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183との間をT2A配列でつなぐことで、tdTomatoとBioID2-3×FLAG-RNF183を別々に発現させることにした。ノックインに成功したマウスを得たため、今後の解析のために現在交配中である。
RNF183によるNKCC1のユビキチン化部位を同定するため、NKCC1のN末端欠失変異体およびC末端欠失変異体を作製し、ユビキチン化部位の同定を行った。その結果、NKCC1のC末端欠失変異体においてRNF183による分解が阻害されたことから、RNF183がNKCC1のN末端をユビキチン化することが示唆された。さらに、C末端のユビキチン化部位であるリジン残基を変異させた細胞も複数作製した。
RNF183の生理的基質を同定するため、RNF183を発現するマウス集合管細胞mIMCD-3に、ポリユビキチン鎖に高い親和性を持つTUBEを安定発現する細胞を樹立した。さらに、この細胞のRNF183をノックアウトした細胞も樹立した。この細胞を用いて、TUBEに結合したタンパク質からRNF183依存的なユビキチン化タンパク質を質量分析により同定することを現在試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度からのノックインマウスのマイクロインジェクションの遅れにより、ノックインマウスの解析は全体的に遅れていたが、本年度分はノックインマウスの作出まで順調に進行した。また、細胞の解析についても、BioID2のノックイン細胞からTUBEシステムを用いた細胞に切り替えることができたため、昨年度の遅れを取り戻すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
BioID2のノックインマウスとTUBE発現細胞を用いて、RNF183の生理的基質の同定を個体および細胞レベルで進める。
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