血管形成と神経発生のクロストーク：脳血管形態形成メカニズムの解明

• 研究課題/領域番号: 21K06740
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 基金
• 応募区分: 一般
• 審査区分: 小区分48010:解剖学関連
• 研究機関: 岩手医科大学
• 研究代表者: 木村 英二 岩手医科大学, 医学部, 准教授 (50405750)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• 研究課題ステータス: 交付 (2022年度)
• 配分額: 4,290千円 (直接経費: 3,300千円、間接経費: 990千円); 2023年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2022年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円); 2021年度: 1,430千円 (直接経費: 1,100千円、間接経費: 330千円)
• キーワード: 血管形成 / ゼブラフィッシュ / CRISPR/Cas9 / ゲノム編集 / 神経発生 / 脳血管 / CRISPR

研究開始時の研究の概要

本研究では、小型魚類のゼブラフィッシュを材料とし、脳血管系の形成過程においてその周囲組織である神経系の発生がどのような影響を与えているのかを明らかにする。そのために神経発生過程で発現する遺伝子の発現パターンを脳血管系の形成過程を照らし合わせ、30の遺伝子群を選定した。これらの標的遺伝子群をゲノム編集技術であるのCRISPR/Cas9法で遺伝子破壊することで機能を喪失させ、脳血管系の形態形成への影響をイメージングにより評価する。なお簡便にイメージングにより評価できるよう血管系で特異的に緑色蛍光を発現し、かつ全て細胞の細胞膜で赤色蛍光を発現している遺伝子組み換えゼブラフィッシュを使用する。

研究実績の概要

本研究では、小型魚類のゼブラフィッシュを材料とし、脳血管系の形成過程における神経発生の関与、血管形成と神経発生のクロストークの解明を目的とする。そのために神経発生過程における遺伝子の発現パターンを脳血管系の形成過程と照らし合わせることで、関連が想起される発現パターンを示す遺伝子群を選定した。これらの標的遺伝子群を近年急速に普及しているゲノム編集技術であるCRISPR/Cas9法を用いてノックアウトし、脳血管系の形態形成への影響を評価する。また魚類では進化の早い段階でゲノムの倍化が生じており、パラログ遺伝子により機能が補完されている可能性が想定される。パラログ遺伝子を同時にノックアウトすることで確実に表現型を示す系統を作成し解析を進める。2021年度には、対象遺伝子を再確認し、それら全てのsgRNAを合成し、受精卵へ一通りインジェクションしゲノム活性評価を実施するところまで進捗した。しかしながら約半数ではゲノム編集活性を確認することができなかったため、2022年度には改めて残りの遺伝子群のゲノム編集活性を有するsgRNAの合成を試みた。しかしながら多くの遺伝子群では、この段階でも活性を認めなかったため、残りの研究期間との兼ね合いも考慮しIDTによるcrRNAの導入を行った。crRNAではtracrRNAと合わせてインジェクションすることでsgRNAと同等以上のゲノム編集が可能となる。またこの導入によりsgRNAの作成に時間を取られることなく研究を進めていくことが可能となり、その結果 予定した遺伝子群でゲノム編集能を有するsgRNAをすべて取得することができた。2022年度内で全ての対象遺伝子に対するsgRNAのインジェクションを終わらせており、今後F0世代が成長した段階で順次potential founderの同定を行い破壊体の系統樹立を目指していく。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

2021年度には、選定した計31遺伝子の破壊実験のために使用するsgRNAの設計を行い、併せてsgRNAのゲノム編集活性能を評価するHMA法で使用するcheck primerも各sgRNAに対して設計した。そして合成したsgRNAを、血管系で特異的に蛍光を発する遺伝子組み換え体の受精卵に対してインジェクションを行い、HMA法によりゲノム編集活性を評価すると同時に、表現型の有無をF0世代で確認した。その結果、約半数でゲノム編集活性を確認できたが、残りの半数では十分な編集活性は認められなかった。これらの傾向として年度後半にインジェクションしたものほどゲノム編集活性能が低い傾向があることから、sgRNAの合成してからの保存に問題がある可能性が考えられた。またインジェクションしたF0世代で、個体発生に重篤な影響を示すものは複数確認できたが、明確な血管パターンの変異のみを示すものは得られなかったため、表現型の評価をF2世代で行うこととした。2022年度にはゲノム編集活性を認められなかった遺伝子に対して再度同様にsgRNAの作成し、インジェクションを行った。しかしながら多くの遺伝子群では、この段階でもゲノム編集活性が認めることが出来なかった。そのため残りの研究期間との兼ね合いも考慮しIDTによるcrRNAの導入を行った。crRNAではtracrRNAと合わせてインジェクションすることでsgRNAと同等以上のゲノム編集が可能となり配列を打ち込むだけで1週間後には納入されインジェクションが可能となる。crRNAの導入により予定した遺伝子群でゲノム編集能を有するsgRNAをすべて取得することができ、2022年度内で全ての対象遺伝子に対するsgRNAのインジェクションを終わらせることができた。今後F0世代が成長次第、順次potential founderを同定し破壊体の系統樹立を目指す。

今後の研究の推進方策

すでにゲノム編集活性が確認できたsgRNAのインジェクションは終了しており、インジェクションしたF0世代の胚は現在飼育中である。F1世代を得られるようになった段階でpotential F0を同定するとともに、フレームシフトを生じる変異パターンを同定して遺伝子破壊体の樹立を目指していく。多くの対象遺伝子は、パラログ遺伝子も含めた複数遺伝子での同時破壊体を目指しており、複数の遺伝子破壊が揃わないと表現型の確認はできないため表現型の確認までには時間を要することが想定される。そこで進行状況に応じて、遺伝子ごとに優先順位を設定して、解析を進めていく。現在血管系で特異的に蛍光をはする遺伝子組み換え体をバックグランドとして使用可能であり、表現型の評価は速やかにライトシート顕微鏡を用いて行う。ライトシート顕微鏡の使用に関しては、基礎生物学研究所 時空間解析室の野中准教授との共同研究で使用可能な状態となっている。またモルフォリノアンチセンスオリゴ（MO）による遺伝子抑制実験も並行して進めていく。しかしながらMOは一遺伝子あたり7万ほど経費がかかるため慎重にその対象遺伝子は選定する。以上の方法により、ゲノム編集による表現型の確認、MOによる遺伝子抑制による評価を行い、脳血管系の形態構築メカニズムの解明を目指す。