| 研究課題/領域番号 |
21K06789
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 基金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 審査区分 |
小区分48020:生理学関連
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
小比類巻 生 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (40548905)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| 研究課題ステータス |
交付 (2023年度)
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| 配分額 *注記 |
4,160千円 (直接経費: 3,200千円、間接経費: 960千円)
2023年度: 1,040千円 (直接経費: 800千円、間接経費: 240千円)
2022年度: 910千円 (直接経費: 700千円、間接経費: 210千円)
2021年度: 2,210千円 (直接経費: 1,700千円、間接経費: 510千円)
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| キーワード | サルコメア / In vivoイメージング / 心筋細胞 / ナノ計測 / 心筋収縮 / リズム調節 / サルコメア動態 / ナノレベル解析 / in vivoイメージング / in vivo イメージング |
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| 研究開始時の研究の概要 |
本研究では、心筋サルコメア動態のin vivoナノ解析を興奮収縮連関の解析に発展させ、「リズム調整とその変調」の観点から心疾患病態を系統的かつ定量的に解析する。「in vivo心臓におけるサルコメアの同調性」と心筋細胞の膜電位や細胞内Ca2+濃度の関係を、独自に開発した高速共焦点蛍光顕微鏡を使用して解析する。次に不整脈を起こす心疾患モデルマウスにおける分子レベルの「リズム調節」が正常と比べてどのように変化しているかを調査する。正常ならびに病態時における「サルコメア同調性の変化と分子レベルリズム調整」という新たな視点から、心疾患の新規診断・治療法の開発に向けた指針を得る。
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| 研究実績の概要 |
令和５年度は研究実施計画に沿って、マウスin vivo左心室の心筋細胞内ナノ計測システム（２光路系を含む）を用いて、生きたマウスの心筋細胞の興奮収縮連関に関係する２要素（例：サルコメア動態と細胞内Ca2+濃度）の動態解析を行った。
１）前年度に開発したサルコメア協調性、Ca2+動態、膜電位のナノレベル解析法を心疾患モデルマウス（異型狭心症、TAC心不全、DCM）に応用し、in vivoにおける正常心筋と病態心筋の間でサルコメア同調性、Ca2+イオン動態、膜電位動態における変調の有無を確認、ナノレベルの情報を抽出し定量的に解析する予定であったが、in vivoイメージングに使用する共焦点正立顕微鏡が原因不明の像質低下に陥ったため、実験を止めて原因究明に努め、令和５年度末近い時期に修理を完了し、像質の向上を確認した。
２）時期特異的α-ACTN2-AcGFPノックインマウスの作製を研究協力者とともに行い、α-ACTN2-AcGFP KIマウスを得た。当該のマウスは既に研究代表者の所属機関への移入が完了している。α-ACTN2-AcGFP遺伝子をホモ接合で持つマウスを作成するため、令和５年度末から交配をスタートしている。
３）生きたマウスの心臓におけるサルコメア同調性解析を用いて左心室容積、左心室圧を一過性に変化させた際の個々のサルコメア間の同調性が心機能にどのような影響を与えるかを調査した。大静脈クランプの影響下において、平均サルコメア長は約0.1μm低下したが、クランプの終了を待たずに速やかに伸展して元の長さに回復した。また個々の単一サルコメア動態が筋原繊維の収縮弛緩への貢献する度合（CI）を導入して解析を行ったところ、クランプ期間を通してサルコメア同士の協働性は保たれていることを示した（論文作成中）。また、（２）（３）の研究成果は第101回日本生理学会大会において発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）令和４年度に開発したサルコメア協調性、Ca2+動態、膜電位のナノレベル解析法をin vivoマウス心臓および病態心臓に応用した。つづいてin vivoにおけるサルコメア同調性、Ca2+イオン動態、膜電位動態における変調の有無を確認、ナノレベルの情報を抽出し定量的に解析する予定であったが、in vivoイメージングに使用する共焦点正立顕微鏡が原因不明の像質低下に陥ったため実験を止めて原因究明に努め、令和５年度３月に修理を完了し、修理前に比べ像質の向上を確認したので、精力的にデータ取得を行った。
２）α-ACTN2-AcGFP KIマウスの作製が完了し、Creマウス、そして病態マウスとの交配を進め、in vivo病態サルコメア動態解析のための準備を進めている。
３）生きたマウスの心臓におけるサルコメア同調性解析を用いてマウスの左心室容積、左心室圧を一過性に変化させた際の個々のサルコメア間の同調性が心機能にどのような影響を与えるかを調査した。（２）（３）の研究成果は第101回日本生理学会大会において発表した。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和６年度は研究実施計画に従って以下の研究を遂行する予定である。
前年度に遂行する予定だったが、顕微鏡修理のため行えなかった各実験を行う。具体的には、サルコメア協調性、Ca2+動態、膜電位のナノレベル解析法を、前年度に開発したZ線標識モデルマウスと心疾患モデルマウス（異型狭心症、TAC心不全、DCM）に応用し、in vivoにおける正常心筋と病態心筋の間でサルコメア同調性、Ca2+イオン動態、膜電位動態における変調の有無を確認、ナノレベルの情報を抽出し定量的に解析する。前年度に確立した手法を用いて、細胞内局所のサルコメアの動きとCa2+濃度や膜電位との関係に、正常心筋と病態心筋の間で差があるかどうかを調べる。
α-ACTN2-AcGFP KIマウスの作製に成功したので、マウスを交配してACTN2-AcGFP遺伝子ホモ接合のKIマウスをその後の交配に使用する。またこのマウスを使用して心疾患モデルを作製し、サルコメア動態にどのような変化があるか解析する予定である。さらに代表者らの以前の研究で、DCMモデルマウスの心臓では心筋細胞が~35%拡大していること、介在板-介在板間距離が増加していることを発見しているため、この事実を基に、α-ACTN-AcGFP KIマウス（または心筋症モデルマウスとの交配で得られたヘテロマウス）において、サルコメア動態と膜電位・介在板動態の関係を調査する。具体的には、これらの病態モデルマウスの心筋細胞にFluoVolt膜電位指示薬を用いてイメージングする。In vivoにおける各要素の関係性を定量的に抽出し、正常と病態の差を調査する。
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